[發明專利]重組人硫氧還蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 201210014016.9
• 申請日: 2012-01-18
• 公開（公告）號: CN102586201A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 陶凌;屈延;孫璐;郭云萍;高超;張立劍
• 申請（專利權）人: 陶凌
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 蔣常雪

技術領域

本發明屬于醫藥生物技術領域，涉及一種重組人硫氧還蛋白的制備方法，具體涉及從原核表達重組人硫氧還蛋白，重組人硫氧還蛋白的純化及鑒定，構建重組人硫氧還蛋白菌種庫、測定種子庫的傳代穩定性，鑒定重組人硫氧還蛋白的體外生物活性等。

背景技術

硫氧還蛋白(Trx)是分子量約為12kDa的小分子蛋白質，它的氨基酸序列中含有調節氧化還原活性的二硫鍵/巰基，該結構位于保守序列：Cys-Gly-Pro-Cys中，為其活性中心。氧化條件下，Cys32和Cys35之間形成二硫鍵(Trx-S2)，該二硫鍵能被TrxR通過NADPH供氫還原，還原型Trx(Trx-(SH)2)含有巰基。Trx就是通過二硫鍵和巰基的互換來實現其氧化還原調節功能的。研究發現Trx廣泛存在于原核生物、真核生物、植物和哺乳動物中，結構高度保守，人類Trx有105個氨基酸組成。哺乳動物細胞中的Trx在活性中心以外還存在另外3個半胱氨酸殘基，可以通過后修飾改變Trx的活性。

人的Trx可分為胞漿型(Trx1)和線粒體型(Trx2)兩種亞型。Trx系統，包括Trx、Trx還原酶(TrxR)、還原型輔酶II(NADPH)和Trx過氧化物酶(TrxP)，是一個控制細胞還原/氧化狀態和細胞增殖/生存的廣泛表達的氧化還原酶系統。Trx在TrxR的作用下可以從氧化型轉變為還原型，還原型的Trx可以催化許多含有二硫鍵蛋白質的還原反應。TrxP可以在還原型Trx的參與下將過氧化氫還原為H₂O。研究發現，Trx除了基本的氧化還原調節功能，還有抗炎、抗凋亡等許多其他生物學活性，因而其與人類疾病的關系日益受到人們的重視。

人體內的Trx是一類防御蛋白，能對多種應激狀況做出響應，對細胞進行保護。除了其抗氧化效應，Trx具有抗凋亡和抗炎作用，并且抑制白細胞趨化和趨化因子的表達。已證明在動物模型中，在心血管疾病中扮演著重要角色，是維持心血管穩態的關鍵調節分子。動物體內注射重組人Trx或者Trx在動物體內的過表達都可以有效地發揮抗氧化和抗炎作用。可以通過減少氧化/硝化應激、抑制心肌細胞凋亡來減弱心肌缺血/再灌注損傷，改善心臟功能，減少心梗面積，從而發揮其心臟保護作用。

并且Trx溶解性好，作為其它蛋白的融合表達標簽，可以有效促進蛋白的可溶性表達。Trx有較好的熱穩定性，在4℃可保存一個月以上，可以短時間耐受80℃的溫度。Trx在哺乳動物體內的半衰期并不相同，在小鼠體內是1小時，大鼠是2小時，猴子是8小時，隨尿液排出體外。

雖然硫氧還蛋白有著廣泛的應用前景，但目前用于實驗室及臨床試驗的Trx主要有兩大類，其中主要以從動物組織中提取的多見，但從動物組織中提取的Trx產量少、純度低、免疫源性強、價格昂貴。還有少數是采用基因工程重組的，但這些基因工程重組的Trx大都是帶有標簽的，這種帶有標簽的Trx無法應用與人體，只有少數是不帶標簽的，但大多僅限于實驗室規模，工藝可行度低、難以擴大生產，無法滿足成藥性評價這些都使Trx應用受到限制。

發明內容

本發明的目的是提供一種人硫氧還蛋白的制備方法，本發明的制備方法步驟簡單，快速可靠，成本低，僅僅使用了兩步離子交換層析就完成了純化過程，且純度達到95％以上。此方法制備的人硫氧還蛋白具有生物學活性，可以和鼠抗人硫氧還蛋白抗血清特異性結合，還可使胰島素二硫鍵還原，其活性和標準品無差別。

“重組人硫氧還蛋白”(rhTrx)的DNA序列如SEQ?ID?No：1所示。

本發明的重組人硫氧還蛋白的制備方法，其特征在于，該制備方法包含以下步驟：

1)誘導培養含有重組人硫氧還蛋白的重組菌，離心獲得菌體；2)超聲波裂菌，破碎細胞，離心，收集上清；3)將步驟2)得到的上清上樣于陰離子交換層析柱，收集目的蛋白所在洗脫峰，得到一次純化產物；4)將得到的一次純化產物上樣于陽離子交換層析柱，收集目的蛋白所在洗脫峰，得到重組人硫氧還蛋白。最終獲得純度達95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或100％的目的蛋白質。

步驟1)中，當培養至OD600nm達到7-8時，加入終濃度為1mM的IPTG作為誘導劑，所述菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

本發明所述人硫氧還蛋白的基因序列如SEQ?ID?NO：1所示。

步驟2)中，加入裂菌緩沖液進行裂菌，菌體和裂菌緩沖液的比例為1g菌體加10ml裂菌緩沖液，所述裂菌緩沖液為STE裂菌緩沖液，該裂菌緩沖液由100mM?NaCl、1mMEDTA、pH?8.0的50mM?Tris-HCl組成。