[發(fā)明專利]具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210012796.3
• 申請日: 2012-01-16
• 公開（公告）號(hào): CN102533861A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛菁萍;高冬妮;平文祥;樓莊偉
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/866
• 分類號(hào): C12N15/866;C12N15/66
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 韓末洙

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和方法的發(fā)展及應(yīng)用，桿狀病毒已被開發(fā)成為高效的真核表達(dá)載體系統(tǒng)，用于各種外源基因的表達(dá)，并作為一種新型的疫苗、基因治療載體受到人們的高度重視。目前篩選重組桿狀病毒的方法有很多，諸如酵母-昆蟲細(xì)胞、大腸桿菌-昆蟲細(xì)胞的穿梭載體的開發(fā)、桿狀病毒DNA線性化和體外定點(diǎn)酶促重組等。但是這些方法的重組效率較低、重組病毒篩選的周期較長、很難同時(shí)分離多個(gè)重組桿狀病毒、基因表達(dá)的效率也很低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有重組桿狀病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)效率低的問題，提供具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法。

本發(fā)明具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、PCR擴(kuò)增Bacmid?DNA中的gp64sp片段；二、PCR擴(kuò)增pCMV-VSVG中的VSVGED片段；三、融合PCR擴(kuò)增gp64sp-VSVGED融合片段；四、將GV片段引入pMD18-T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T-GV；五、構(gòu)建質(zhì)粒pFastBac1-GV；六、PCR擴(kuò)增pFastBac1-GV中的pHGV片段，將pHGV片段引入pMD18-T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pGM18-T-pHGV；七、PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pTriEx-2Hygro中的CBA啟動(dòng)子，將CBA啟動(dòng)子克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T-CBA；八、構(gòu)建質(zhì)粒載體pFastBac[pH-]-pHBOX；九、構(gòu)建質(zhì)粒載體pSD-CBA；十、構(gòu)建質(zhì)粒載體pSD；十一、PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pAAV-LacZ中的L-ITR片段和R-ITR片段，將L-ITR片段引入質(zhì)粒載體pSD，構(gòu)建質(zhì)粒pSD-L-ITR；十二、將R-ITR片段引入質(zhì)粒pSD-L-ITR，構(gòu)建pSD-ITRs；十三、PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pEGFP-C3中的EGFP基因，將EGFP基因克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T-EGFP；十四、構(gòu)建質(zhì)粒pSD-EGFP；十五、構(gòu)建質(zhì)粒pSD-ITRs-EGFP；十六、質(zhì)粒pSD-EGFP和質(zhì)粒pSD-ITRs-EGFP分別轉(zhuǎn)化DH10Bac細(xì)胞，獲得重組載體Bacmid-SD-EGFP和Bacmid-SD-ITRs-EGFP；十七、利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將Bacmid-SD-EGFP和Bacmid-SD-ITRs-EGFP轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒BV-SD-EGFP和BV-SD-ITRs-EGFP；其中步驟一中PCR擴(kuò)增引物為SD-1和SD-2，引物SD-1為5′-CGCGGATCCATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAG-3′，引物SD-2為5′-ATTTTTGGATAGCCCAGTATCCGCAAAGGCAGAATGC-3′；步驟二中PCR擴(kuò)增引物為SD-2和LM-2，引物L(fēng)M-2為5′-CCCAAGCTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTCTAT-3′；步驟三中融合PCR擴(kuò)增引物為LM-3和SD-2，引物L(fēng)M-3為5′-CGCGGATCCATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAG-3′；步驟六中PCR擴(kuò)增引物為LM-1和LM-2，引物L(fēng)M-1為5′-TGCTCTAGATTCGCATCCTCGGTTTTCTG-3′；步驟七中PCR擴(kuò)增引物為SD-3和SD-4，引物SD-3為5′-GCTCTAGAGCCGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAAC-3′，引物SD-4為5′-GTGAATTCCGGAGCTCTGCTCGAGCGAGGCCTAGCCGCCGGTCACACGCC-3′；步驟十一中PCR擴(kuò)增引物為LM-11和LM-12，引物L(fēng)M-11為5′-TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3′，引物L(fēng)M-12為5′-TGCTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3′；步驟十三中PCR擴(kuò)增引物為eGFP-f和eGFP-r，引物eGFP-f為5′-ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3′，引物eGFP-r為5′-TCAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′。