[發明專利]具有CBA啟動子的可表達EGFP的重組桿狀病毒的構建方法

無效

• 申請號: 201210012796.3
• 申請日: 2012-01-16
• 公開（公告）號: CN102533861A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 葛菁萍;高冬妮;平文祥;樓莊偉
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 韓末洙

1.具有CBA啟動子的可表達EGFP的重組桿狀病毒的構建方法，其特征在于具有CBA啟動子的可表達EGFP的重組桿狀病毒的構建方法，按以下步驟進行：

一、PCR擴增Bacmid?DNA中的gp64sp片段；二、PCR擴增pCMV-VSVG中的VSVGED片段；三、融合PCR擴增gp64sp-VSVGED融合片段；四、將GV片段引入pMD18-T載體，構建質粒pMD18-T-GV；五、構建質粒pFastBac1-GV；六、PCR擴增pFastBac1-GV中的pHGV片段，將pHGV片段引入pMD18-T載體，構建質粒pGM18-T-pHGV；七、PCR擴增質粒pTriEx-2Hygro中的CBA啟動子，將CBA啟動子克隆至pMD18-T載體，構建質粒pMD18-T-CBA；八、構建質粒載體pFastBac[pH-]-pHBOX；九、構建質粒載體pSD-CBA；十、構建質粒載體pSD；十一、PCR擴增質粒pAAV-LacZ中的L-ITR片段和R-ITR片段，將L-ITR片段引入質粒載體pSD，構建質粒pSD-L-ITR；十二、將R-ITR片段引入質粒pSD-L-ITR，構建pSD-ITRs；十三、PCR擴增質粒pEGFP-C3中的EGFP基因，將EGFP基因克隆至pMD18-T載體，構建質粒pMD18-T-EGFP；十四、構建質粒pSD-EGFP；十五、構建質粒pSD-ITRs-EGFP；十六、質粒pSD-EGFP和質粒pSD-ITRs-EGFP分別轉化DH10Bac細胞，獲得重組載體Bacmid-SD-EGFP和Bacmid-SD-ITRs-EGFP；十七、利用脂質體介導轉染法將Bacmid-SD-EGFP和Bacmid-SD-ITRs-EGFP轉染Sf9細胞，獲得重組桿狀病毒BV-SD-EGFP和BV-SD-ITRs-EGFP；其中步驟一中PCR擴增引物為SD-1和SD-2，引物SD-1為5′-CGCGGATCCATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAG-3′，引物SD-2為5′-ATTTTTGGATAGCCCAGTATCCGCAAAGGCAGAATGC-3′；步驟二中PCR擴增引物為SD-2和LM-2，引物LM-2為5′-CCCAAGCTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTCTAT-3′；步驟三中融合PCR擴增引物為LM-3和SD-2，引物LM-3為5′-CGCGGATCCATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAG-3′；步驟六中PCR擴增引物為LM-1和LM-2，引物LM-1為5′-TGCTCTAGATTCGCATCCTCGGTTTTCTG-3′；步驟七中PCR擴增引物為SD-3和SD-4，引物SD-3為5′-GCTCTAGAGCCGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAAC-3′，引物SD-4為5′-GTGAATTCCGGAGCTCTGCTCGAGCGAGGCCTAGCCGCCGGTCACACGCC-3′；步驟十一中PCR擴增引物為LM-11和LM-12，引物LM-11為5′-TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3′，引物LM-12為5′-TGCTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3′；步驟十三中PCR擴增引物為eGFP-f和eGFP-r，引物eGFP-f為5′-ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3′，引物eGFP-r為5′-TCAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′。