[發明專利]鑒定紫花苜蓿種子真偽的試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201210012201.4
• 申請日: 2012-01-14
• 公開（公告）號: CN102643896A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 劉志鵬;馬利超;王彥榮
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張真

技術領域

本發明主要涉及鑒定紫花苜蓿種子真偽的方法及其專用引物。具體涉及鑒定紫花苜蓿種子真偽的基因檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

紫花苜蓿(Medicago?sativa?L.)，是我國和全世界種植面積最大的豆科牧草，具有優質、高產、飼用價值高(粗蛋白含量21％)、適口性好、用途廣泛等特點，被世界譽為“牧草之王”。白花草木樨(Melilotus?albus?M.)和黃花草木樨(Mel.officinalis?L.)統稱草木樨，其營養價值不僅低于紫花苜蓿(粗蛋白含量16％)，而且含有有毒物質“香豆素”，帶有苦味，適口性很低。而這兩種牧草的種子、幼苗、葉片和干草在外觀形態上極其相似(圖1)，分辨十分困難。生產中兩種牧草種子一旦混雜，將對紫花苜蓿的種植和利用產生不可挽回的損失。

隨著畜牧業的發展，我國紫花苜蓿播種面積已達210多萬公頃，年需種子3萬噸左右，其中每年依賴進口紫花苜蓿種子2萬噸左右(洪紱曾，2003)。我國紫花苜蓿的種子生產主要集中在甘肅、陜西和內蒙古三省區，年產量約1萬噸，占全國總產量的82.6％(蘇嘉楷，1995)。但是據農業部蘭州牧草及草坪草質量監督檢測中心抽檢結果顯示，西北市場上流通的紫花苜蓿種子質量合格率僅為40％，主要問題是其它植物種子(主要是草木樨種子)含量超標。另外，出口紫花苜蓿種子時，外商要求其中草木樨種子含量不得超過2％，因而準確迅速鑒定出紫花苜蓿種子中草木樨種子的含量，對于提高我國紫花苜蓿種子的質量具有十分重要的意義。

準確迅速區分并鑒定紫花苜蓿和草木樨種子，是紫花苜蓿種子質量檢驗中的一大難題。前人對兩種牧草種子的鑒定技術進行了很多嘗試性的研究，并取得了一定的成就，但仍存在明顯的局限性。可將這些方法歸納為三類：(一)根據種子氣味、形態和色澤等形態學特征進行區分(王振業，1987)。但是由于兩個草種的種子外形和顏色十分相似，不易區分，特別是受到成熟度不一致、種質間遺傳變異，以及環境、氣候等因素的影響造成種子表觀形態發生變化，這種情況下鑒定工作的難度更大，鑒定結果的誤差也較大；(二)采用熒光方法，將供試種子按標準發芽法均勻播于培養皿中，置于20℃恒溫箱中，分別于4、8、12、16、20和24小時取出，移至暗室在紫外分析儀下鑒定，吸漲的紫花苜蓿種子發出黃色熒光(孫建華，1996)。此方法雖然可以鑒定出吸漲的紫花苜蓿種子和草木樨種子，但是對于兩種牧草的壞死種子和硬實種子無法鑒定、而且靈敏度較低、過程繁瑣、機理不明等缺點；(三)田間鑒定，這種方法是將種子播種于試驗田，待出苗后每隔7～10天觀察一次，直至2-6個月，最后鑒定出紫花苜蓿和草木樨(Iannucci等，2002)。此種方法雖能準確地鑒定出紫花苜蓿和草木樨，但是缺點也非常明顯，該方法具有成本高、周期長和效率低等不足，會嚴重地影響紫花苜蓿的種植和生產。因此，目前國內外還沒有一個統一的、行之有效的鑒別紫花苜蓿種子真偽的方法。

發明內容

本發明的目的一是彌補現有檢測技術的不足，提出一種通過PCR檢測紫花苜蓿種子真偽的專用引物。

本發明的目的二是提供一種檢測紫花苜蓿種子的試劑盒。

本發明的目的三是提供一種檢測紫花苜蓿檢測方法。

本發明的實施，可以快速、高效和準確地鑒定紫花苜蓿種子和干草的真偽。此方法省時省力，操作簡便，在實驗室內能較短時間完成。為了驗證該方法的有效性，我們從200余份紫花苜蓿種質中，隨機選取21個紫花苜蓿品種，發現該方法可準確地鑒定出這21份材料。表明該方法可使用范圍廣，具有很強的推廣價值，有助于種子檢驗人員對紫花苜蓿種子和草木樨種子的區分，可確保紫花苜蓿更好的為畜牧業生產服務，為保障我國的糧食安全打下堅實的基礎。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

一種鑒定紫花苜蓿種子和干草真偽的專用引物，其主要特點包括：

第一組紫花苜蓿專用引物：MsITS-F(5′-3′)：TTTTTGAACGCAAGTTGCGC，

????????????????????????MsITS-R(5′-3′)：CAACCAACCACGAGACAGA；

第二組草木樨專用引物：MoITS-F(5′-3′)：TTGGCCTCCCGTGAGCTCTATT，

??????????????????????MoITS-R(5′-3′)：CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGC。

一種鑒定紫花苜蓿種子真偽的試劑盒，其主要特征包括：