[發明專利]鑒定紫花苜蓿種子真偽的試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201210012201.4
• 申請日: 2012-01-14
• 公開（公告）號: CN102643896A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 劉志鵬;馬利超;王彥榮
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張真

1.一種鑒定紫花苜蓿種子真偽的專用引物，其特征包括：

第一組紫花苜蓿專用引物：MsITS-F(5′-3′)：TTTTTGAACGCAAGTTGCGC，

????????????????????????MsITS-R(5′-3′)：CAACCAACCACGAGACAGA；

第二組草木樨專用引物：MoITS-F(5′-3′)：TTGGCCTCCCGTGAGCTCTATT，

??????????????????????MoITS-R(5′-3′)：CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGC。

2.一種鑒定紫花苜蓿種子真偽的試劑盒，其特征包括：

第一組：紫花苜蓿PCR檢測體系，其中包括2×PCR?Master10μl，為3mM?MgCl₂，0.2mMdNTP，0.1U/μl?Taq和2×PCR?Buffer；引物MsITS-F：TTTTTGAACGCAAGTTGCGC?1μl，引物MsITS-R：CAACCAACCACGAGACAGA?1μl，以及ddH₂O?7μl；

第二組：草木樨PCR檢測體系，其中包括2×PCR?Master10μl，為3mM?MgCl₂，0.2mMdNTP，0.1U/μl?Taq和2×PCR?Buffer；引物MoITS-F：TTGGCCTCCCGTGAGCTCTATT?1μl，引物MoITS-R：CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGC?1μl，以及ddH₂O?7μl。

3.一種鑒定紫花苜蓿種子真偽的方法，其特征包括如下步驟：

A.收集種子，采用雙層濾紙萌發法，20℃萌發72小時，提取萌發種子基因組DNA備用；

B.利用第一組紫花苜蓿專用引物，對種子基因組DNA進行PCR檢測；PCR檢測體系總體積為20μl，其中包括2×PCR?Master10μl，為3mM?MgCl₂，0.2mM?dNTP，0.1U/μl?Taq和2×PCR?Buffer；DNA模板，濃度為200ng/μl?1μl；引物MsITS-F，濃度為10nM?1μl，引物MsITS-R，濃度為10nM?1μl，以及ddH₂O?7μl；PCR擴增條件為：(1)95℃預變性2分鐘；(2)95℃變性30秒；(3)61℃退火30秒；(4)72℃延伸30秒；(5)第2～4步驟循環30次；(6)72℃延伸5分鐘；

C.利用第二組草木樨專用引物，對種子基因組DNA進行PCR檢測；PCR檢測體系的總體積為20μl，其中包括2×PCR?Master10μl，為3mM?MgCl₂，0.2mM?dNTP，0.1U/μl?Taq和2×PCR?Buffer；DNA模板，濃度為200ng/μl?1μl；引物MoITS-F濃度為10nM?1μl，引物MoITS-R濃度為10nM?1μl，以及ddH₂O?7μl；PCR擴增條件為：(1)95℃預變性2分鐘；(2)95℃變性30秒；(3)70℃退火30秒；(4)72℃延伸30秒；(5)第2～4步驟循環10次，從第二個循環開始每循環一次退火溫度降低0.5℃；(6)95℃變性30秒；(7)65℃退火30秒；(8)72℃延伸30秒；(9)第6～8步驟循環20次；(10)72℃延伸5分鐘。

4.一種鑒定紫花苜蓿干草真偽的方法，其特征包括如下步驟：

A.選擇干草，提取基因組DNA備用；

B.利用第一組紫花苜蓿專用引物對干草基因組DNA進行PCR檢測；PCR檢測體系總體積為20μl，其中包括2×PCR?Master10μl，為3mM?MgCl₂，0.2mM?dNTP，0.1U/μl?Taq和2×PCR?Buffer；DNA模板濃度為200ng/μl?1μl；引物MsITS-F濃度為10nM?1μl，引物MsITS-R濃度為10nM?1μl，以及ddH₂O?7μl；PCR擴增條件為：(1)95℃預變性2分鐘；(2)95℃變性30秒；(3)61℃退火30秒；(4)72℃延伸30秒；(5)第2～4步驟循環30次；(6)72℃延伸5分鐘；

C.利用第二組草木樨專用引物對干草基因組DNA進行PCR檢測；PCR檢測體系的總體積為20μl，其中包括2×PCR?Master10μl，為3mM?MgCl₂，0.2mM?dNTP，0.1U/μl?Taq和2×PCR?Buffer；DNA模板濃度為200ng/μl?1μl，引物MoITS-F濃度為10nM?1μl，引物MoITS-R濃度為10nM?1μl，以及ddH₂O?7μl；PCR擴增條件為：(1)95℃預變性2分鐘；(2)95℃變性30秒；(3)70℃退火30秒；(4)72℃延伸30秒；(5)第2～4步驟循環10次，從第二個循環開始每循環一次退火溫度降低0.5℃；(6)95℃變性30秒；(7)65℃退火30秒；(8)72℃延伸30秒；(9)第6～8步驟循環20次；(10)72℃延伸5分鐘。