[發明專利]一種用OMC685-1細胞分離培養呼吸道合胞病毒的方法

無效

• 申請號: 201210012069.7
• 申請日: 2012-01-16
• 公開（公告）號: CN102559608A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 敖弟書;吳中明;彭志元;唐君;肖福峰
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;G01N33/569
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

技術領域

本發明涉及一種呼吸道合胞病毒的分離培養方法，具體涉及一種用OMC685-1細胞分離培養呼吸道合胞病毒的方法。

背景技術

呼吸道合胞病毒(respiratory?syncytial?virus，RSV)屬于副粘病毒科肺炎病毒屬，電鏡下形態多樣，可以是纖毛狀或近似球狀。

RSV對環境中各種因素的耐受力很差，較高的溫度、低pH、有機溶劑、去污劑等都能使它很快滅活。因此臨床分離病毒時要求盡快接種到敏感細胞上。RSV能在一些傳代細胞中生長，例如HEp-2，HeLa，HFF，A549以及恒河猴腎細胞。在理想條件下，最早可在接種后兩天看到RSV特有的融合細胞，但通常需要4-5天才能看到細胞病變效應（CPE）。雖然病毒培養是從臨床標本中檢測RSV的最好方法，但傳統的細胞管方法因耗時較長(1～2周)。小瓶培養法可接種相同量的標本，可將分離時間從7～10天減少到1～2天，因此得到廣泛應用。OMC685細胞系是本單位萬啟惠、李宗權、徐大剛和吳中明等建立的一株人卵巢粘液性囊腺癌細胞系，文獻來源：《人卵巢粘液性囊腺癌細胞系的建立及生物學特性的研究》，中華婦產科雜志，2001年7月第36卷第7期，421-423。本發明中的OMC685-1細胞是OMC685細胞系采用有限稀釋法克隆純化得到的。

本發明采用OMC685-1細胞做呼吸道合胞病毒分離工具，用倒置顯微鏡觀察細胞病變效應和間接免疫熒光法檢測病毒。

發明內容

本發明要解決的技術問題：解決目前RSV病原體分離存在的靈敏度低、費時較長等問題，本發明用人卵巢粘液性囊腺癌細胞（OMC685-1）作為工具，分離RSV病毒，與傳統的病毒分離方法相比提高了檢測的靈敏度，并縮短了培養時間。

本發明采用的技術方案：

本發明用OMC685-1細胞做呼吸道合胞病毒分離工具，倒置顯微鏡觀察細胞病變效應，再用間接免疫熒光法確認病毒。??

本發明用OMC685-1細胞分離培養呼吸道合胞病毒的方法，：包括以下步驟：

（1）培養OMC685-1細胞：OMC685-1細胞復蘇后接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養液中，置于相對濕度為95﹪～98﹪，37℃，5﹪CO₂及37℃條件下培養；每2～3d換液1次，4～5d傳代1次；將生長良好的細胞用0.25﹪胰酶消化后制成細胞懸液，以1×10⁵個/孔的密度接種于96孔培養板，0.1?ml/孔，置于37℃、5﹪CO₂培養箱中培養，待細胞貼壁后感染病毒；

（2）感染OMC685-1細胞，用PBS反復沖洗96孔培養板三次，吸干孔內剩余PBS液，每孔接種40ul含呼吸道合胞病毒的標本，對照孔接種PBS液40ul，感染1-2h后用無血清RPMI-1640培養液沖洗96孔培養板三次，吸干孔內剩余液體，每孔加入0.1ml維持液，含2%小牛血清的RPMI-1640培養液，每4-12h倒置顯微鏡下觀察一次是否出現細胞病變效應；

（3）收集感染細胞做間接免疫熒光法檢測確認病毒。

本發明達到的有益效果：

本課題組研究OMC685-1發現，對RSV敏感性較高，低滴度的RSV即引起細胞出現CPE，用RSV抗體檢測RSV，可在OMC685-1細胞胞漿內發現明顯的綠色熒光顆粒；對感染OMC685-1細胞或上清提取RNA，逆轉錄后用RSV特異引物進行PCR擴增，可以擴增出單一目的條帶，由此說明OMC685細胞對RSV敏感，可以用來分離培養RSV。