[發(fā)明專利]一株產(chǎn)瓜氨酸的菌株及用該菌株生物合成瓜氨酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210012037.7
• 申請日: 2012-01-16
• 公開（公告）號: CN102433290A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設計）人: 張濤;江波;王瑩;繆銘;沐萬孟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P13/10;C12R1/46
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發(fā)明涉及能夠生產(chǎn)瓜氨酸的一種從土壤中篩出的微生物菌株糞腸球菌（Enterococcus?faecalis）SK23.001及其培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)瓜氨酸及含有精氨酸脫亞氨酶的菌體，并將該菌體用于生物制備瓜氨酸的方法，屬于食品生物技術領域。瓜氨酸廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。

背景技術

瓜氨酸具有提高免疫系統(tǒng)功能，維護關節(jié)運動的機能，平衡正常的血糖水平，含豐富的抗氧化劑吸收有害的自由基，幫助保持膽固醇的正常水平。它也可以使人的血管獲得松弛，用于增強男性性功能，以及治療性功能障礙。還可以維護健康的肺功能以及提高腦力清晰度，降低壓力和克服沮喪情緒，有幫助腦神經(jīng)細胞具貯藏與調(diào)回訊息的功能。隨著生物技術和遺傳工程研究的迅速發(fā)展，生物化學制品市場也得到了持續(xù)增加，世界年銷售額高達幾十億美元。因此對很多生物制品如酶類，疫苗，抗體等的保存受到越來越多的重視。瓜氨酸清除羥基的功能得到了很好的利用，研究表明瓜氨酸對DNA和酶具有抗羥基保護。瓜氨酸作為抗氧化劑，可以用于化妝品，保健食品，食品添加劑以及營養(yǎng)強化劑，同時還可對厭氧物質(zhì)提供保護。因此，人們對瓜氨酸越來越重視，并寄希望于開發(fā)出新型的功能食品和功能藥物。

至今為止，瓜氨酸的制造方法，主要有四種。

第一，是從植物中提取的方法。來自天然，但提取率和含量低。

第二，化學有機合成瓜氨酸的方法。該法可能會殘留毒性物質(zhì)，安全性有待考量，且生成物分離精制操作復雜。

第三，利用微生物酶法進行生產(chǎn)。酶法生產(chǎn)瓜氨酸即采用Streptococcus?faecalis，Clostridium?perfringens，Micrococcus?pyogenes，Bacillus?pyocyaneus等微生物生產(chǎn)的精氨酸脫亞氨基，用該酶由精氨酸生產(chǎn)瓜氨酸。

第四，發(fā)酵法進行生產(chǎn)。發(fā)酵法的優(yōu)點是成本低，產(chǎn)量高，產(chǎn)物的純度高，在產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中沒有有毒物質(zhì)的產(chǎn)生，給產(chǎn)物后加工提供了方便，降低了成本，且適合大規(guī)模的生產(chǎn)。

國外在瓜氨酸方面的研究較多，尤其是在日本、美國和歐洲。在瓜氨酸的制備方法上，國外主要采用發(fā)酵法和酶法生產(chǎn)，分離純化多數(shù)使用離子交換等常用的分離方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的：本發(fā)明在深入調(diào)查和研究了現(xiàn)有技術基礎上，并從土壤中篩出多株生產(chǎn)瓜氨酸的菌株進行了研究，最終篩選到一株能高產(chǎn)瓜氨酸的微生物。

其二，提供該菌株發(fā)酵生產(chǎn)或與精氨酸溶液的全細胞轉(zhuǎn)化的方法，以得到高的轉(zhuǎn)化率和較純的瓜氨酸產(chǎn)品。

再者，提供一種瓜氨酸分離純化與精制的方法，以得到高純度的瓜氨酸。

本發(fā)明的技術方案：本發(fā)明提供一種來源于土壤高產(chǎn)瓜氨酸的菌株，是通過根據(jù)一定法則的菌類學性質(zhì)、生物化學性質(zhì)的分析和16sRNA序列的測定而得出其分類命名為（Enterococcus?faecalis）SK23.001。已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M?2011465。

利用該微生物CCTCC?NO：M?2011465為出發(fā)菌株，通過發(fā)酵生產(chǎn)瓜氨酸或通過發(fā)酵獲得具有精氨酸脫亞氨酶活的靜息細胞，然后作用于精氨酸轉(zhuǎn)化合成瓜氨酸，步驟如下：

（1）種子培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基：L-Arg?1-20g/L，酵母膏1-20g/L，蛋白胨1-20g/L，葡萄糖5-100g/L，無機氮源1.0-10.0g/L以及加或不加少量無機鹽等，調(diào)pH4.0-7.5；

種子培養(yǎng)條件：菌株于30-37℃、100-300rpm的振蕩速度下在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-30h活化該菌株。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基：L-Arg?1-100g/L，酵母膏1-20g/L，蛋白胨1-20g/L，葡萄糖5-100g/L，無機氮源1.0-10.0g/L以及加或不加少量無機鹽等，調(diào)pH4.0-7.5；

發(fā)酵條件：接種量1%-10%，30-37℃、轉(zhuǎn)速180-500r/m的條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵5-72h，獲得獲得具有酶活的發(fā)酵液及濕菌體。

（3）發(fā)酵后處理

發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心后收集上清液含瓜氨酸的發(fā)酵液及具有精氨酸脫亞氨酶活的濕菌體，并用0.1%的生理鹽水和pH6.0的0.1mol/L醋酸鹽緩沖液清洗菌體，得靜息細胞用于進行全細胞轉(zhuǎn)化反應，經(jīng)檢測轉(zhuǎn)化率在80%以上。