[發明專利]人β-防御素3在酵母菌表達系統中的表達方法

無效

• 申請號: 201210012016.5
• 申請日: 2012-01-16
• 公開（公告）號: CN102586256A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 唐語謙;吳暉;肖俊梅;汪芳;袁琨;李曉鳳;劉冬梅;余以剛;肖性龍
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/81;C07K14/47
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

技術領域

?本發明公開了一種人β-防御素3的表達方法，特別是指一種在酵母菌表達系統中表達人β-防御素3的方法。

背景技術

防御素是抗菌肽家庭中最大的亞家族，是生物體內產生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性多肽活性物質，是生物體先天免疫的重要組成部分，與干擾素、補體等組成了宿主的免疫防御系統。截止目前研究發現防御素的種類有：哺乳動物防御素、昆蟲防御素和植物防御素；而根據二硫鍵的位置，連接上的差異以及前體和表達方式不同，防御素又分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素3類。

人β-防御素3（human?β-defensin-3，hBD-3）是2001年Harder等在銀屑病患者皮損組織中發現的防御素β家族抑菌活性最高的肽。hBD-3是由45個氨基酸組成的小分子多肽，相對分子質量為5154.7，由1個α螺旋和3個反向平行的β折疊片層組成，同時有一個短螺旋環在氨基末端區域形成。hBD-3由6個半胱氨酸殘基形成3個二硫鍵，其連接方式為2～4、1～5、3～6。3個反向平行的β折疊片層通過17～19、27～31、39～43殘基形成。hBD-3是兩親結構，包括疏水端和親水端，疏水端聚集在肽表面的底部，正電荷在它的表面兩端是不對稱分布的。

相較于其他β防御素而言，人β-防御素3的功能性更廣：（一）顯著的抗細菌、抗真菌及抗病毒的活性，且抑菌濃度比已經觀察到的防御素家族的其他成員更低；（二）在連接先天和獲得性免疫應答中起到重要的橋梁作用；（三）誘導專職抗原遞呈細胞產生和活化，有望成為疫苗佐劑；（四）其抗菌活性是非鹽離子濃度敏感性的，不易引起溶血。在濫用抗菌藥物，細菌耐藥性問題日益嚴重的今天，人β-防御素3因具有高效殺菌、不易產生耐藥性突變、無毒、適用性廣、性能穩定等優點，有望代替傳統的抗生素，開發成為新一代抗細菌、真菌、病毒和抗癌的藥物，應用開發前景廣闊。

但是，要將人β-防御素3真正應用于生產實踐，必須首先建立成本低廉、高效穩定的制備工藝，解決工業批量化生產問題。目前，防御素主要通過以下3種途徑獲得：（1）誘導生物體分泌表達后分離純化；（2）化學合成；（3）構建防御素基因工程菌株。但天然存在的防御素產量很低，無法從動植物體內大量提取，且分離純化具有抗菌活性的組成無疑是一件非常繁瑣的工作；而化學合成防御素也存在成本高，大批量生產困難的弱點，因此，前2種方法無法滿足防御素工業化生產的需求。相較而言，以工程菌工業化發酵生產防御素，可大規模生產，其生產周期短、生產成本低且不受季節和氣候變化等外在環境影響，因而探索適當的防御素誘導途徑成為該領域研究的焦點。有許多實驗對不同來源的防御素進行了重組表達嘗試，涉及的表達系統包括大腸桿菌系統、酵母系統等。

自基因工程等生物技術發展以來，國內外學者對借助于基因工程菌制備人β-防御素3展開了廣泛的研究，包括基因的獲取、使用受體菌偏好基因人工合成基因、表達載體的構建、以及采用融合蛋白策略實驗人β-防御素3在大腸桿菌的高效表達。黃蓬亮（黃蓬亮,?趙亞華,?許少鵬.?人β防御素3在大腸桿菌中可溶性表達及其生物活性的鑒定.?生命科學研究,?2005,?9(2):?129-133）等根據大腸桿菌對精氨酸密碼子使用偏好合成了人β-防御素3，在大腸桿菌中誘導表達成功。李春麗等（李春麗,?何國慶,?崔淑貞.?人β防御素3基因的合成及其克隆.?河南農業大學學報,?2005,?39(3):?282-285）根據已知人β-防御素3的成熟區氨基酸序列和酵母密碼子的偏好，人工合成人β-防御素3基因，并成功構建真核表達載體pPIC9k-hBD-3。庹曉曄等（庹曉曄,?徐明達,?陳璧,?等.?人β防御素3在大腸桿菌中的融合表達及其抗微生物活性的初步分析[J].?軍事醫學科學院院刊,?2004,?28(2):?114–122）構建了人β-防御素3基因真核表達載體并在大腸桿菌中表達成功。李春麗等（李春麗,?徐雪麗,?鄭振宇,?等.?人β防御素3和植物des-pGLu1-brazzein融合蛋白表達菌的誘導條件優化及其活性分析.?生物工程學報,?2008,?24(3):?485-490）對人β-防御素3和植物甜蛋白?des-pGlu1-Brazzein?嵌合基因的工程菌株BL-pET-hBD3-Bra的IPTG誘導表達條件進行了研究，經優化目的蛋白表達量占總蛋白的35%左右。何國慶等（何國慶,?李春麗,?阮暉等.?人β防御素3與植物甜蛋白Brazzein嵌合基因的合成及其在大腸桿菌中的表達.?農業生物技術學報,?2005,?13(2):?217-220）嵌合人β-防御素3與植物甜蛋白Brazzein基因，在大腸桿菌中誘導表達后，目的蛋白約占總蛋白的30%。