[發明專利]人β-防御素3在酵母菌表達系統中的表達方法

無效

• 申請號: 201210012016.5
• 申請日: 2012-01-16
• 公開（公告）號: CN102586256A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 唐語謙;吳暉;肖俊梅;汪芳;袁琨;李曉鳳;劉冬梅;余以剛;肖性龍
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/81;C07K14/47
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

1.人β-防御素3在酵母菌表達系統中的表達方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）目的基因hBD-3的擴增；

（2）雙酶切hBD-3基因與載體pPIC9k，連接構建重組載體，轉化宿主菌巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）；

（3）篩選后的轉化子再用甲醇誘導培養，離心所得上清液中即為人β防御素3。

2.根據權利要求1所述的表達方法，其特征在于，所述甲醇誘導培養是挑取轉化子接種于50?mL?BMGY液體培養基，30℃、200?r/min振蕩培養18h至OD₆₀₀為2～6，5000?r/min離心5?min收集菌體，菌體用滅菌水水洗兩次，將菌體用BMMY液體培養基重懸至OD₆₀₀值為0.8～1.2，每24h補加甲醇至終濃度為0.5%v/v，28℃，200r/min連續誘導培養5天。

3.根據權利要求1所述的表達方法，其特征在于，所述BMGY液體培養基為1%wt酵母提取物，2%wt蛋白胨，1.34%wtYNB，0.0004‰wt生物素，100?mM?pH?6.0磷酸鹽緩沖液，1%wt甘油。

4.根據權利要求1所述的表達方法，其特征在于，所述轉化宿主菌前先將重組質粒用Sac?I酶進行線性化。

5.根據權利要求1所述的表達方法，其特征在于，所述目的基因hBD-3的獲取方法是：

設計上游引物為：5’-ATCGAATTCATGGGAATCATAAACACATTACAGA-3’，

下游引物為：5’-TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT-3’；以含hBD-3序列的T載體為模板，PCR擴增出末端帶有EcoR?I和Not?I酶切位點的目的基因，?PCR擴增條件如下：94℃變性2?min進入循環，94℃變性30?S，68℃退火50?S，72℃延伸1?min，35個循環后于72℃繼續延伸10?min。

6.根據權利要求1所述的表達方法，其特征在于，所述雙酶切所用限制性內切酶為EcoR?I和Not?I。

7.根據權利要求1所述的表達方法，其特征在于，所用的宿主為巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）GS115。