[發(fā)明專利]由間接競爭時間分辨熒光免疫分析體系檢測煙草中菌核凈殘留的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210011642.2
• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN102590499A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉媛;劉賢金;張霄;王冬蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 孫忠浩

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種由CI-TRFIA檢測體系檢測煙草中菌核凈殘留的方法。

背景技術(shù)：

菌核凈(N-3，5-二氯苯基丁二酰胺)是一種高效、低毒的亞胺類殺菌劑。它具有廣譜、殺菌、內(nèi)吸、滲透、持效期長等特點，廣泛用于煙草赤星病和水稻紋枯病的防治。考慮到菌核凈殘留對人類健康和環(huán)境存在潛在風險，建立煙草中菌核凈殘留的檢測方法勢在必行。然而，我國煙草中菌核凈的殘留限量尚未制定，檢測標準也僅有煙草行業(yè)標準制定的氣相色譜法[煙草及煙草制品菌核凈農(nóng)藥殘留量的測定氣相色譜法.中華人民共和國煙草行業(yè)標準.YC/T218-2007]。Liu等[Liu?H?C，Li?Q?W，Tang?L?B.Capillary?gas?chromatographic?determination?of?dimethachlon?residues?in?fresh?tobacco?leaves?and?cut-tobacco.Zhejiang?Univ.Sci.B，2007，8(4)：272～276]報道了菌核凈在鮮煙葉和煙絲中的氣相色譜法檢測方法，檢測線性范圍為0.01～0.1mg/kg。劉蓉蓉等采用菌核凈-2-戊二酸半酯為半抗原，制備了菌核凈多克隆抗體，并采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測煙草中菌核凈殘留[劉蓉蓉，劉賢金，劉媛，方敦煌，胡秋輝.菌核凈殘留免疫分析半抗原的制備和鑒定.食品科學(xué)，2007，2：223-226][劉蓉蓉.菌核凈的免疫檢測技術(shù)研究，南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2007]，抗體的抑制終濃度I₅₀為2830μg/L，檢測靈敏度偏低。

時間分辨熒光免疫分析是20世紀80年代發(fā)展起來的非放射型免疫分析方法，它采用稀土族元素作為標記物，克服了ELISA的穩(wěn)定性差的缺點，也避免了放射性免疫分析(RIA)的同位素污染等問題，具有靈敏度高、抗基質(zhì)干擾能力強、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點。

建立菌核凈農(nóng)藥高靈敏度檢測的CI-TRFIA分析體系，并通過CI-TRFIA分析體系檢測煙草中菌核凈殘留，目前未報道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于：針對目前菌核凈檢測方法研究較少，且已報道的氣相色譜檢測方法和酶聯(lián)免疫檢測方法靈敏度偏低的問題，本發(fā)明提供了一種菌核凈殘留的時間分辨熒光免疫分析方法，并將其應(yīng)用于煙草中菌核凈殘留檢測，開發(fā)了簡便快速、無需樣本凈化的前處理方法。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一種由CI-TRFIA檢測體系檢測煙草中菌核凈殘留的方法，其特征在于：

所述的CI-TRFIA檢測體系中，以菌核凈-OVA作為包被抗原，以菌核凈多克隆抗體作為識別抗體，以Eu-N1標記的羊抗兔IgG作為二抗，建立與菌核凈農(nóng)藥對應(yīng)的標準抑制曲線，方法是：將菌核凈-卵清蛋白OVA連接物作為包被抗原固定于酶標板，再加入梯度稀釋的菌核凈標準品和菌核凈多克隆抗體，讓菌核凈標準品與包被抗原共同競爭結(jié)合抗體，再采用Eu-N1標記的羊抗兔IgG作為二抗，通過時間分辨檢測模式讀數(shù)后，繪制菌核凈時間分辨免疫分析的標準抑制曲線，建立線性回歸方程，計算抑制中濃度，確定最低檢測限和線性檢測范圍；

所述的檢測煙草中菌核凈殘留是指：對煙草樣品前處理后，通過CI-TRFIA檢測體系對其進行檢測，判斷與樣品對應(yīng)的煙草中菌核凈殘留量。

在本發(fā)明中：所述的Eu-N1標記的羊抗兔IgG是這樣獲得的：稱取4mgEu-N1，用350μL蒸餾水溶解，備用；將1mg親和純化后的羊抗兔IgG溶于150μL蒸餾水，加入pH?9.8的15μL?0.5mol/L碳酸鹽緩沖液，混合均勻后，將溶解的Eu-N1與羊抗兔IgG混合，4℃靜置過夜，次日將過夜的反應(yīng)物裝入截留分子量為8000Da的透析袋中，對超純水透析3天，截留物為Eu-N1標記的羊抗兔IgG，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在本發(fā)明中：對煙草樣品前處理是指：將煙草樣品粉碎后，稱取1g放入100mL三角瓶中，加20mL丙酮混合均勻，180rpm振蕩提取1小時，抽濾后濃縮近干，再用10ml丙酮復(fù)溶殘余物并定容，取100μL丙酮復(fù)溶物，用檢測緩沖液稀釋10倍后，直接用于CI-TRFIA檢測。

本發(fā)明采用了菌核凈-OVA作為包被抗原、菌核凈多克隆抗體作為識別抗體和鑭系元素螯合物Eu-N1標記的羊抗兔IgG作為二抗，建立了高靈敏度的菌核凈時間分辨熒光免疫分析方法，并將其應(yīng)用于煙草中菌核凈殘留檢測，開發(fā)了簡便快速、無需樣本凈化的前處理方法，為國內(nèi)外首次報道。