[發(fā)明專利]一種豬捷申病毒的體外分離方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210010912.8
• 申請(qǐng)日: 2012-01-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102533672A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宮曉文;王美君;張志榜;趙亞榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司;福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬捷申病毒的體外分離方法。

背景技術(shù)

豬傳染性腦脊髓炎，又稱豬捷申病是由豬捷申病毒(Porcine?Teschovirus，PTV)引起的，可以引起豬腹瀉、呼吸道癥狀、豬腦脊髓灰質(zhì)炎、繁殖障礙、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮膚損傷等多種表現(xiàn)的一種病毒性傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)。

豬捷申病毒，原屬于小RNA科，腸道病毒屬，1999年病毒分類學(xué)委員會(huì)將腸道病毒屬豬腸道病毒中的11個(gè)血清型列為捷申病毒屬。由于臨床上一般豬捷申病毒都是與其他病毒混合感染豬群，并且捷申病毒與臨床常見(jiàn)的豬病病毒一樣，都可以在IBRS-2細(xì)胞、PK-15細(xì)胞、ST細(xì)胞等豬腎傳代細(xì)胞系上生長(zhǎng)，并且產(chǎn)生的細(xì)胞病變也不是特別典型，因此給豬捷申病毒分離與純化帶來(lái)一定困難。

噬斑純化是用細(xì)胞分離病毒的常見(jiàn)的純化方法，是利用某些病毒可以在細(xì)胞上形成肉眼可見(jiàn)的病變的特點(diǎn)，利用低熔點(diǎn)瓊脂糖固定使得病變的病毒可以逐個(gè)挑出，一般認(rèn)為一個(gè)噬斑就是一個(gè)病毒，一般經(jīng)過(guò)三輪噬斑純化，就可以得到較為純凈的病毒，這種病毒經(jīng)過(guò)檢測(cè)可以作為科研與疫苗制備中的種毒使用。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種豬捷申病毒的體外分離方法。

本發(fā)明的一種豬捷申病毒的體外分離方法，其包括如下步驟：

1)從臨床上診斷為疑似豬捷申病毒感染的豬病料中獲取用nRT-PCR鑒定為陽(yáng)性，并進(jìn)行過(guò)濾除菌的病料上清液；

2)用步驟1)獲得的病料上清液感染豬腎傳代細(xì)胞系，連續(xù)傳代培養(yǎng)至90％以上的細(xì)胞出現(xiàn)病變，其中，每代在收毒時(shí)均取上清進(jìn)行nRT-PCR檢測(cè)，保留PCR陽(yáng)性的病毒液繼續(xù)傳代；

3)將步驟2)傳代培養(yǎng)后的豬捷申病毒用噬斑純化方法進(jìn)行純化。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中步驟1)具體包括如下步驟：

用細(xì)胞培養(yǎng)液研磨所述的豬病料，反復(fù)凍融2～4次，8000～12000rpm冷凍離心5～30min，取上清液進(jìn)行總RNA的提取，進(jìn)行nRT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)為陽(yáng)性的病料上清液用0.22μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌。

其中，細(xì)胞培養(yǎng)液和豬病料的液固比為1～10∶0.5～10(ml∶g)。

在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟3)具體包括如下步驟：

將豬腎傳代細(xì)胞系培養(yǎng)成單層細(xì)胞，將步驟2)獲得的病毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋0～9次后，以0.01～0.2ml/cm²細(xì)胞的量接種細(xì)胞，搖勻后置37℃感作30min～2h，吸棄病毒液，用減血清培養(yǎng)基Opti-MEM以0.1～0.3mL/cm²細(xì)胞的量，洗滌1～2次后，將37℃含2％～6％胎牛血清的2×DMEM與60℃低熔點(diǎn)瓊脂糖均勻混合后鋪于細(xì)胞上，厚度為2～4mm，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h后挑選單個(gè)噬斑，接種于所述的豬腎傳代細(xì)胞系上擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)三輪噬斑純化后，將最后一次挑取的噬斑接種于所述的豬腎傳代細(xì)胞系擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)鑒定后作為純化的病毒。

其中，所述的病料優(yōu)選為肺臟、腸和/或腦組織，更優(yōu)選為小腦組織。

其中，所述的豬腎傳代細(xì)胞系優(yōu)選為IBRS-2、PK-15或ST細(xì)胞系，更優(yōu)選為PK-15細(xì)胞系。

其中，步驟2)中連續(xù)傳代培養(yǎng)的代數(shù)優(yōu)選為5～10代。

本發(fā)明的方法是以臨床收集的樣本，經(jīng)巢式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(nRT-PCR)檢測(cè)為豬捷申病毒陽(yáng)性，通過(guò)研磨、離心、過(guò)濾等處理后，用體外傳代細(xì)胞系豬腎傳代細(xì)胞系進(jìn)行分離培養(yǎng)，并用噬斑試驗(yàn)進(jìn)行純化，以及通過(guò)nRT-PCR和免疫熒光方法鑒定為純化的PTV病毒。該分離純化方法特異性高、敏感性強(qiáng)，能快速、特異地分離純化豬捷申病毒。

附圖說(shuō)明

圖1所示nRT-PCR檢測(cè)結(jié)果。其中，從左至右依次為DL2000DNA?Marker、第一輪PCR陽(yáng)性目的條帶(321bp)、第二輪PCR陽(yáng)性目的條帶(158bp)、陰性目的條帶對(duì)照。

圖2所示為豬捷申病毒在PK-15上的CPE(×100)。

圖3所示為正常無(wú)病變的PK-15細(xì)胞(×100)。

圖4所示為豬捷申病毒熒光鑒定照片(×200)。

圖5所示為熒光陰性對(duì)照照片(×200)。

圖6所示為豬捷申病毒噬斑純化圖片。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。