[發明專利]一種豬捷申病毒的體外分離方法

無效

• 申請號: 201210010912.8
• 申請日: 2012-01-14
• 公開（公告）號: CN102533672A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 宮曉文;王美君;張志榜;趙亞榮
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司;福州大北農生物技術有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種豬捷申病毒的體外分離方法，其包括如下步驟：

1)從臨床上診斷為疑似豬捷申病毒感染的豬病料中獲取用nRT-PCR鑒定為陽性，并進行過濾除菌的病料上清液；

2)用步驟1)獲得的病料上清液感染豬腎傳代細胞系，連續傳代培養至90％以上的細胞出現病變，其中，每代在收毒時均取上清進行nRT-PCR檢測，保留PCR陽性的病毒液繼續傳代；

3)將步驟2)傳代培養后的豬捷申病毒用噬斑純化方法進行純化。

2.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，其中步驟1)具體包括如下步驟：

用細胞培養液研磨所述的豬病料，反復凍融2～4次，8000～12000rpm冷凍離心5～30min，取上清液進行總RNA的提取，進行nRT-PCR擴增，檢測為陽性的病料上清液用0.22μm的過濾器進行過濾除菌。

3.根據權利要求2所述的分離方法，其特征在于，其中，細胞培養液和豬病料的液固比為1～10∶0.5～10。

4.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，其中步驟3)具體包括如下步驟：

將豬腎傳代細胞系培養成單層細胞，將步驟2)獲得的病毒液進行10倍倍比稀釋0～9次后，以0.01～0.2ml/cm²細胞的量接種細胞，搖勻后置37℃感作30min～2h，吸棄病毒液，用減血清培養基Opti-MEM以0.1～0.3mL/cm²細胞的量，洗滌1～2次后，將37℃含2％～6％胎牛血清的2×DMEM與60℃低熔點瓊脂糖均勻混合后鋪于細胞上，厚度為2～4mm，在37℃、5％CO₂培養箱中培養，72h后挑選單個噬斑，接種于所述的豬腎傳代細胞系上擴大培養，經三輪噬斑純化后，將最后一次挑取的噬斑接種于所述的豬腎傳代細胞系擴大培養，經鑒定后作為純化的病毒。

5.根據權利要求1～4任一項所述的分離方法，其特征在于，其中步驟1)中所述的病料為肺臟、腸和/或腦組織。

6.根據權利要求1～4任一項所述的分離方法，其特征在于，所述的豬腎傳代細胞系為IBRS-2、PK-15或ST細胞系。

7.根據權利要求1～4任一項所述的分離方法，其特征在于，其中步驟2)中連續傳代培養的代數為5～10代。