[發明專利]一種從膠原蛋白制備RGD活性多肽的方法

無效

• 申請號: 201210010561.0
• 申請日: 2012-01-14
• 公開（公告）號: CN102533917A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 劉濤;朱家勇;金小寶;尹輝
• 申請（專利權）人: 廣東藥學院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/20;C07K14/78;A61K38/39;A61K8/64;A61K49/00;A61P35/00;A61P7/02;A61Q19/00;A23L1/29
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及一種從膠原蛋白制備RGD活性多肽的方法。

背景技術

膠原蛋白是由動物細胞合成的一類蛋白質家族，膠原蛋白由三條肽鏈組成，肽鏈自身為左手螺旋結構，三條α肽鏈則以平行右手螺旋形式纏繞成三股螺旋結構而構成膠原蛋白分子。膠原蛋白可根據多肽的氨基酸序列差異及其交聯方式分為多種類型，現在已經發現30余種不同類型的膠原蛋白。不同類型的膠原蛋白顯示出高度的歧異性，包括大小、序列、組織分布和分子組成等，各類型膠原蛋白在理化性質、組織分布和合成機制以及在胚胎期、成年期的結構與功能上存在一定差異。目前，膠原蛋白多肽開發的重點集中于采用化學法、酶法及其耦合實現膠原蛋白制備工藝及不同分子量范圍的膠原多肽分離分級，所分離組分區分度和特征性均存在不足。

膠原蛋白在體內具有重要的生物學功能，含有多種生物活性肽。Byuu?HG和KIM?SK等人首先利用堿性蛋白酶、鏈酶蛋白酶E和膠原酶共同水解魚膠原蛋白，進而利用凝膠過濾、離子交換和反相層析分離到兩種具有抑制血管緊張素轉化酶活性的三肽Gly-Pro-Leu和Gly-Pro-Met?[Process?Biochemistry,?2001,36:1155-1162]，他們采用同樣的方法水解牛膠原蛋白，得到了具有類似活性的三肽Gly-Pro-Val?[Journal?of?Agriculture?Food?Chemistry,2001,49:?2992-2997]。XY?Gao等人以酶解明膠為原料，采用纖維連接蛋白親和色譜法-凝膠過濾和反相層析法，分離得到具有抗腫瘤活性的12肽和15肽，此兩肽位于膠原蛋白的非三螺旋核心區[European?Journal?of?Pharmaceutics?and?Biopharmaceutics,?1998,?45:?275-284]。Maruyama?S等人從豬膠原蛋白嗜熱菌蛋白酶水解液中分離的Gly-Pro-Arg是一種纖維蛋白原/凝血酶凝集抑制劑[Biochimica?et?Biophysica?Acta,1993,1164:215-223]。

RGD肽是指含有精氨酸-甘氨酸–天冬氨酸?(Arg-Gly-Asp)序列的多肽，RGD肽是細胞發生特異性識別的結構基礎之一，RGD肽在腫瘤治療、抗血栓、治療急性腎衰等方面均具有一定效果和應用價值。目前RGD肽的制備方式主要有三種：（1）從天然動植物體內提取；（2）化學法合成；（3）重組DNA技術制備。第一種方法針對性強，但RGD肽在生物體內含量極低，大規模制備受限；第二種對結構特殊、或天然不存在的RGD肽制備具有優勢，但該方法成本高，且副產物多；第三種方法應用廣泛，但多適用于制備長肽和蛋白質，對RGD小肽制備不具備成本優勢。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中的上述不足，提供一種從膠原蛋白制備RGD活性多肽的方法。

本發明通過以下技術方案實現上述目的：

一種從膠原蛋白制備RGD活性多肽的方法，步驟如下：

（1）將膠原蛋白溶于水，調節pH值為7.0~9.0；

（2）酶解：在膠原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶，或者不會完全破壞膠原蛋白中RGD序列的酶，如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等，加入量為膠原蛋白質量的1/5000~5/100，?30~45℃條件下酶解，酶解時間為1~8小時，用2,4,6-三硝基苯磺酸衍生-分光光度法測定酶解液吸光度，當吸光度不再增長時視為酶解完成，升高溫度到55~65℃保溫10~30分鐘使胰蛋白酶失活，終止反應，得到膠原蛋白酶解液；

（3）過濾：在15~60℃溫度范圍內，采用截留分子量為3,000~20,000道爾頓的濾膜過濾或采用凝膠過濾色譜法過濾，收集濾液得到膠原蛋白多肽溶液；

（4）將膠原蛋白多肽溶液依次通過親和色譜柱和反相色譜柱，收集洗脫液，冷凍干燥，所得粉末即為膠原蛋白RGD活性多肽。

上述制備方法，其中步驟（2）所述膠原蛋白為動物源未降解的完整膠原蛋白，或者經過酸法、堿法、酶法處理過的膠原蛋白，或直接采用明膠。動物源的膠原蛋白原料可以是人、豬、牛、馬、驢和魚的皮、骨等來源的膠原蛋白。如果采用的膠原蛋白原料直接是水溶液的形式，則可以省去溶于水的步驟，直接調節pH值為7.0~9.0即可。

步驟（2）酶解優選加入胰蛋白酶，胰蛋白酶比活為1,000-5,000?U/mg，使用該比活的酶，能夠在高效酶解膠原蛋白的前提下節省用量，降低生產成本。

步驟（3）濾膜截留分子量優選為5,000道爾頓，適合于小分子RGD活性肽的篩選。