[發(fā)明專利]重組微纖維蛋白溶酶及其制備方法和應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN103205410B
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 藺新力
• 申請（專利權(quán)）人: 藺瑩瑩
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;C12N15/70;A61K38/48;A61P27/02;A61P9/10;A61P7/10;A61P7/04;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽杰克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司21207
• 代理人: 金春華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物學藥物領(lǐng)域，具體地涉及一種應(yīng)用于眼科疾病方面的重組微纖維蛋白溶酶及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

病理性纖維增殖導(dǎo)致的后玻璃體粘連變形是增殖型玻璃體視網(wǎng)膜病變等疾病發(fā)展的結(jié)果。由病理性纖維增殖膜及玻璃體后皮質(zhì)對視網(wǎng)膜的粘連、牽拉，成為影響黃斑性目盲疾病治療和預(yù)后的重要因素。玻璃體切除術(shù)是現(xiàn)今治療增殖型玻璃體視網(wǎng)膜病變等疾病的一種醫(yī)療手段。但是在這些疾病中，病理性纖維增殖膜和玻璃體后皮質(zhì)與視網(wǎng)膜緊密粘連，難于完整剝離，手術(shù)難度大，并發(fā)癥多。因此探尋分離玻璃體后皮質(zhì)、松解病理性纖維增殖膜與視網(wǎng)膜之間的粘連的新方法成為當前亟待解決的難題。

糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變是目前的多發(fā)病之一。糖尿病已成為威脅人類健康的第三大殺手，中國的糖尿病患者人數(shù)第一、增長速度最快，目前患病人數(shù)接近一個億。糖尿病嚴重時可累及全身各個器官，引起多種并發(fā)癥，致死致殘。視網(wǎng)膜病變是糖尿病的主要并發(fā)癥，已成為主要致盲眼病。玻璃體黃斑粘連是其病變和預(yù)后的主要因素。如上所述，現(xiàn)今治療方案是用外科手術(shù)完全切除玻璃體后皮質(zhì)及病理性纖維增殖膜，解除其對視網(wǎng)膜黃斑的粘連和牽拉。 此手術(shù)方法具有費用高、手術(shù)難度大，及因剝離不完全而導(dǎo)致術(shù)后并發(fā)癥多等缺點。因此現(xiàn)在有廣大的糖尿病患者因得不到治療而導(dǎo)致盲目。非手術(shù)、簡便和經(jīng)濟的藥物治療玻璃體黃斑粘連是當前的迫切需求。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種重組微纖維蛋白溶酶，通過對患者的眼部玻璃體或/和水狀體施加一定有效量的包括重組微纖維蛋白溶酶的藥物組合物，以溶解玻璃體和/或引起玻璃體后脫離。本發(fā)明可用于降低玻璃體粘性，溶解玻璃體，誘導(dǎo)玻璃體后脫離，降低眼內(nèi)出血，清除或降低對眼睛有毒的物質(zhì)，增加眼部用藥的擴散，減低外視網(wǎng)膜新血管生成及任何以上病狀的復(fù)合。本發(fā)明可輔助或者代替?zhèn)鹘y(tǒng)的機械玻璃體切除術(shù)。應(yīng)用本發(fā)明的酶解法可避免手術(shù)，應(yīng)用簡單，使病理性纖維增殖膜及玻璃體后皮質(zhì)對視網(wǎng)膜的粘連剝離完全，無并發(fā)癥，及治療費用低廉。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種重組微纖維蛋白溶酶原多肽，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

一種利用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)上述的重組微纖維蛋白溶酶原多肽的方法，步驟如下：

（1）將編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列插入基于質(zhì)粒的大腸桿菌E.coli表達載體pET11中，然后傳導(dǎo)到大腸桿菌宿主中，并用氨芐青霉素選擇抗性克隆；所述的編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）重組微纖維蛋白溶酶原多肽的表達、復(fù)性以及純化：① 將（1）中選擇的培養(yǎng)攜帶表達質(zhì)粒的E.coli抗性克隆在培養(yǎng)基中培養(yǎng)到A600=0.6-0.9的生長期；② 加入IPTG誘導(dǎo)蛋白以包涵體形式表達，37 ^oC下繼續(xù)培養(yǎng)3-5小時；③ 離心收獲細菌，然后通過凍融和漂洗得到純化的包涵體；④ 在pH 8-10的8M尿素緩沖液中溶解包涵體；⑤ 將含有包涵體的尿素緩沖液快速稀釋到20倍的20 mM Tris， 0.2 M 精氨酸， pH 9.0的緩沖液中，得復(fù)性蛋白；⑥ 采用分子排阻色譜法將復(fù)性蛋白完全分離出來；⑦ 采用離子交換和親和層析進一步純化復(fù)性蛋白，即為重組微纖維蛋白溶酶原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一種重組微纖維蛋白溶酶：是將上述的重組微纖維蛋白溶酶原多肽經(jīng)活化酶激活成重組微纖維蛋白溶酶。所述的激活酶是尿激酶、組織纖溶酶原激活物、鏈激酶、或普激酶。

上述的重組微纖維蛋白溶酶作為有效成分用于制備治療玻璃體黃斑牽引綜合癥、黃斑裂洞、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜撕裂、視網(wǎng)膜新生血管形成、視網(wǎng)膜出血、視網(wǎng)膜水腫、或者處理玻璃體后脫離不完全的手術(shù)并發(fā)癥的藥物。重組微纖維蛋白溶酶的用量為：每只眼睛0.005毫克-0.2毫克。

本發(fā)明的重組微纖維蛋白溶酶(μPlm)可以溶解造成后玻璃體粘連的纖維蛋白，包括fibronectin和laminin，從而達到酶解法后玻璃體脫離的治療效果。本發(fā)明采用大腸桿菌生產(chǎn)重組μPlm，通過眼部的玻璃體腔注射μPlm可以有效解除玻璃體黃斑粘連，具有特異性強、免疫原性低、副作用小等優(yōu)點。

利用本發(fā)明采用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)的重組μPlm，制備治療玻璃體黃斑粘連的藥物，具有表達量高，生產(chǎn)工藝簡便，生產(chǎn)成本低，和表達蛋白活性穩(wěn)定，制品使用安全等特點。應(yīng)用本發(fā)明可開發(fā)出經(jīng)濟安全，非手術(shù)治療玻璃體黃斑粘連的藥物，以克服目前外科切除手術(shù)所面臨的費用高、手術(shù)難度大和并發(fā)癥多等問題。