[發明專利]重組微纖維蛋白溶酶及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210009986.X
• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN103205410B
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 藺新力
• 申請（專利權）人: 藺瑩瑩
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;C12N15/70;A61K38/48;A61P27/02;A61P9/10;A61P7/10;A61P7/04;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司21207
• 代理人: 金春華

1.一種利用大腸桿菌表達系統生產重組微纖維蛋白溶酶的方法，其特征在于：包括如下合成步驟：

（1）將編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列插入基于質粒的大腸桿菌E.coli表達載體pET11中，然后傳導到大腸桿菌宿主BL21中，并用氨芐青霉素選擇抗性克隆；所述的編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）重組微纖維蛋白溶酶原多肽的表達、復性以及純化：① 將（1）中選擇的培養攜帶表達質粒的E.coli抗性克隆在LB/Ampicillin培養基中培養到A₆₀₀=0.6-0.9的生長期；② 加入IPTG誘導蛋白以包涵體形式表達，37 ^oC下繼續培養3-5小時；③ 離心收獲細菌，然后通過凍融和漂洗得到純化的包涵體；④ 在pH 8-10的8M尿素緩沖液中溶解包涵體；所述的尿素緩沖液中含有20 mM Tris；⑤ 將含有包涵體的尿素緩沖液快速稀釋到20倍的20 mM Tris， 0.2 M 精氨酸， pH 9.0的緩沖液中，用復性方法將變性蛋白復性成它的天然構象，得復性蛋白；⑥采用分子排阻色譜法從部分或全部未折疊的重組微纖維蛋白溶酶原多肽或它的多聚體中將復性蛋白完全分離出來，所述的分子排阻色譜法包括Superdex 200和Superdex 75，層析柱緩沖液為20 mM Tris， 0.2 M 精氨酸， 0.2 M NaCl， pH 8.0；⑦ 采用離子交換和親和層析進一步純化復性蛋白，即為重組微纖維蛋白溶酶原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；⑧ 分子排阻色譜法純化的重組微纖維蛋白溶酶原多肽進一步用離子交換柱和疏水柱方法純化；

（3）將純化的重組微纖維蛋白溶酶原多肽經活化酶激活成重組微纖維蛋白溶酶，所述的活化酶是普激酶；

（4）將激活后得到的重組微纖維蛋白溶酶用離子交換柱層析法純化，然后傳入到穩定緩沖液中儲存，所述的穩定緩沖液包括：20 mM 檸檬酸，10%蔗糖，pH 3.1。

2.按照權利要求1所述的方法制備的重組微纖維蛋白溶酶作為有效成分在制備治療玻璃體黃斑牽引綜合癥、黃斑裂洞、視網膜脫離、視網膜撕裂、視網膜新生血管形成、視網膜出血、視網膜水腫或者處理玻璃體后脫離不完全的手術并發癥藥物中的應用。

3.按照權利要求2所述的應用，其特征在于：重組微纖維蛋白溶酶的用量為：每只眼睛0.005毫克-0.2毫克。