[發明專利]一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法無效
申請號: | 201210009632.5 | 申請日: | 2012-01-13 |
公開(公告)號: | CN102586428A | 公開(公告)日: | 2012-07-18 |
發明(設計)人: | 侯軍;林曉民;張建祥;張春奇;韓文忠 | 申請(專利權)人: | 河南科技大學 |
主分類號: | C12Q1/68 | 分類號: | C12Q1/68;C12Q1/04 |
代理公司: | 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120 | 代理人: | 苗強 |
地址: | 471000 河*** | 國省代碼: | 河南;41 |
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摘要: | |||
搜索關鍵詞: | 一種 玉米 病原 鐮刀 苗期 致病性 檢測 方法 | ||
技術領域
本發明涉及一種檢測方法,具體的說是一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法。
背景技術
玉米是全世界總產量最高的糧食作物。玉米青枯病又稱玉米莖基腐病、基腐病,是世界玉米的主要病害之一。其危害非常大,相關資料報道,有些國家,由于玉米青枯病造成玉米產量的損失可達25—33%,有的甚至高達50%以上。
玉米青枯病是一種土傳病害。由于土壤環境比較復雜,在研究土傳病害,分離其病原菌時經常會受到多種因素的干擾,導致病原菌分離和鑒定的困難。在莖部的維管束病害中,當病害可為肉眼所見時,往往己到病害發展的中后期,不同的寄生菌和腐生菌己在發病部位大量繁殖,同樣很難通過分離的方法來確定病原菌。通過致病性測定雖然可以鑒別分離物的致病屬性,但由于根病和維管束病害所需發病周期長,環境條件不易控制,其它真菌的污染很難排除,因此也不易獲得準確的結論。以往在對玉米青枯病病原菌苗期致病性的報道,多集中在研究玉米根部的發病情況,使用土埋法進行檢測。由于復雜的土壤環境,再加上清洗根時容易對根部造成損傷,易導致統計上的誤差,造成結果不準確,而郭-麥二氏法檢測復雜,同時測定結果易不準確。
發明內容
本發明針對上述問題的不足,提供一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法,其制備方法簡單,操作簡便,檢測結果準確。
本發明涉及的試劑:DNA凝膠回收試劑盒購買于碧云天生物技術研究所,該試劑盒中自配有成品的DNA純化結合液,洗滌液,洗脫液,DNA純化柱,收集管;
本發明中所涉及的玉米青枯病原鐮刀菌為一般市售產品,均可由保藏中心或生物公司購買得到;
本發明為解決上述問題所采用的技術方案是:一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法,所述的檢測方法為:
步驟一、水-瓊脂混合培養基的制備
1)在1000mL水中加入17g瓊脂,加熱使瓊脂溶解,后加入1.5g的硝酸鈣、1.5g的硝酸鉀、1g的磷酸二氫銨和0.5g的硫酸鎂,攪拌均勻,形成混合液,分裝于300mL三角瓶中,每瓶100mL,丙烯膜封口,并留有排氣孔,然后將每一個含有混合液的三角瓶送入高壓滅菌鍋內,在壓強為0.14MPa,溫度為121℃,滅菌30分鐘,制得營養瓊脂培養基,備用;
2)在無菌條件下,將步驟1)中每一個滅菌后的營養瓊脂培養基中加入100mL的去離子水,然后將營養瓊脂培養基攪碎至粒徑為0.5--0.8cm的顆粒時止,混合均勻,形成水-瓊脂混合培養基,備用;
步驟二、玉米苗培養
按重量分數比取1份粒徑為0.8mm的玉米和2份濃度為0.1%的汞,將玉米在汞中浸泡10分鐘,取出,用去離子水洗滌3次,然后將洗滌后的玉米放到底層鋪有無菌濾紙的培養容器中,后在培養容器內加入無菌去離子水,去離子水的加入量淹沒濾紙時止,后將培養容器送入25℃的培養箱內,培養3-4天待玉米發芽后,將玉米芽移植到水-瓊脂混合培養基中,25℃-30℃條件下,見光培養,備用;
步驟三、鐮刀菌接種菌液制備與接種
1)在100mL的去離子水中加入20g的馬鈴薯片,煮20-30分鐘,過濾,得到濾液,后在濾液中加入2g的葡萄糖,混合均勻,然后用去離子水定容至100mL止,制得馬鈴薯液體培養基,備用;
2)在無菌條件下,在馬鈴薯液體培養基中接入一個玉米青枯病原鐮刀菌種,送入搖床上,在25℃條件下,發酵培養培養4-6天,形成玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液,然后在玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液中加入磁力攪拌器,轉速為150轉/分鐘,攪拌160-200分鐘,使整個菌液呈糊狀并能用玻璃吸管定量吸入狀態,后繼續培養24小時,形成鐮刀菌接種菌液,備用;
3)玉米幼苗生長至丙烯膜處,在丙烯膜上開一個玉米生長口,待玉米生長至4-5片葉子時止,在無菌條件下,向培養玉米的三角瓶內加入5-6mL步驟2)中得到的鐮刀菌接種菌液,25-30℃條件下,見光培養10天,得到感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米,備用;
步驟四、對感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米進行檢測
1)取直徑為2cm的感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部,洗凈,然后在研缽內加入取1g感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部、0.5mL的TE溶液、0.5mL的SDS溶液和2g的石英砂,研磨均勻,得到物料,備用;
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