[發(fā)明專利]一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210009632.5
• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN102586428A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設計）人: 侯軍;林曉民;張建祥;張春奇;韓文忠
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 洛陽公信知識產(chǎn)權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 苗強

技術領域

本發(fā)明涉及一種檢測方法，具體的說是一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法。

背景技術

玉米是全世界總產(chǎn)量最高的糧食作物。玉米青枯病又稱玉米莖基腐病、基腐病，是世界玉米的主要病害之一。其危害非常大，相關資料報道，有些國家，由于玉米青枯病造成玉米產(chǎn)量的損失可達25—33%，有的甚至高達50%以上。

玉米青枯病是一種土傳病害。由于土壤環(huán)境比較復雜，在研究土傳病害，分離其病原菌時經(jīng)常會受到多種因素的干擾，導致病原菌分離和鑒定的困難。在莖部的維管束病害中，當病害可為肉眼所見時，往往己到病害發(fā)展的中后期，不同的寄生菌和腐生菌己在發(fā)病部位大量繁殖，同樣很難通過分離的方法來確定病原菌。通過致病性測定雖然可以鑒別分離物的致病屬性，但由于根病和維管束病害所需發(fā)病周期長，環(huán)境條件不易控制，其它真菌的污染很難排除，因此也不易獲得準確的結論。以往在對玉米青枯病病原菌苗期致病性的報道，多集中在研究玉米根部的發(fā)病情況，使用土埋法進行檢測。由于復雜的土壤環(huán)境，再加上清洗根時容易對根部造成損傷，易導致統(tǒng)計上的誤差，造成結果不準確，而郭-麥二氏法檢測復雜，同時測定結果易不準確。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對上述問題的不足，提供一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，其制備方法簡單，操作簡便，檢測結果準確。

本發(fā)明涉及的試劑：DNA凝膠回收試劑盒購買于碧云天生物技術研究所，該試劑盒中自配有成品的DNA純化結合液，洗滌液，洗脫液，DNA純化柱，收集管；

本發(fā)明中所涉及的玉米青枯病原鐮刀菌為一般市售產(chǎn)品，均可由保藏中心或生物公司購買得到；

本發(fā)明為解決上述問題所采用的技術方案是：一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，所述的檢測方法為：

步驟一、水-瓊脂混合培養(yǎng)基的制備

1）在1000mL水中加入17g瓊脂，加熱使瓊脂溶解，后加入1.5g的硝酸鈣、1.5g的硝酸鉀、1g的磷酸二氫銨和0.5g的硫酸鎂，攪拌均勻，形成混合液，分裝于300mL三角瓶中，每瓶100mL，丙烯膜封口，并留有排氣孔，然后將每一個含有混合液的三角瓶送入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強為0.14MPa，溫度為121℃，滅菌30分鐘，制得營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，備用；

2）在無菌條件下，將步驟1）中每一個滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中加入100mL的去離子水，然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基攪碎至粒徑為0.5--0.8cm的顆粒時止，混合均勻，形成水-瓊脂混合培養(yǎng)基，備用；

步驟二、玉米苗培養(yǎng)

按重量分數(shù)比取1份粒徑為0.8mm的玉米和2份濃度為0.1%的汞，將玉米在汞中浸泡10分鐘，取出，用去離子水洗滌3次，然后將洗滌后的玉米放到底層鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)容器中，后在培養(yǎng)容器內(nèi)加入無菌去離子水，去離子水的加入量淹沒濾紙時止，后將培養(yǎng)容器送入25℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3-4天待玉米發(fā)芽后，將玉米芽移植到水-瓊脂混合培養(yǎng)基中，25℃-30℃條件下，見光培養(yǎng)，備用；

步驟三、鐮刀菌接種菌液制備與接種

1）在100mL的去離子水中加入20g的馬鈴薯片，煮20-30分鐘，過濾，得到濾液，后在濾液中加入2g的葡萄糖，混合均勻，然后用去離子水定容至100mL止，制得馬鈴薯液體培養(yǎng)基，備用；

2）在無菌條件下，在馬鈴薯液體培養(yǎng)基中接入一個玉米青枯病原鐮刀菌種，送入搖床上，在25℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)4-6天，形成玉米青枯病原鐮刀菌培養(yǎng)菌液，然后在玉米青枯病原鐮刀菌培養(yǎng)菌液中加入磁力攪拌器，轉速為150轉/分鐘，攪拌160-200分鐘，使整個菌液呈糊狀并能用玻璃吸管定量吸入狀態(tài)，后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，形成鐮刀菌接種菌液，備用；

3）玉米幼苗生長至丙烯膜處，在丙烯膜上開一個玉米生長口，待玉米生長至4-5片葉子時止，在無菌條件下，向培養(yǎng)玉米的三角瓶內(nèi)加入5-6mL步驟2）中得到的鐮刀菌接種菌液，25-30℃條件下，見光培養(yǎng)10天，得到感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米，備用；

步驟四、對感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米進行檢測

1）取直徑為2cm的感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部，洗凈，然后在研缽內(nèi)加入取1g感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部、0.5mL的TE溶液、0.5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均勻，得到物料，備用；