[發明專利]一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法

無效

• 申請號: 201210009632.5
• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN102586428A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 侯軍;林曉民;張建祥;張春奇;韓文忠
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 苗強

1.一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法為：

步驟一、水-瓊脂混合培養基的制備

1）在1000mL水中加入17g瓊脂，加熱使瓊脂溶解，后加入1.5g的硝酸鈣、1.5g的硝酸鉀、1g的磷酸二氫銨和0.5g的硫酸鎂，攪拌均勻，形成混合液，分裝于300mL三角瓶中，每瓶100mL，丙烯膜封口，并留有排氣孔，然后將每一個含有混合液的三角瓶送入高壓滅菌鍋內，在壓強為0.14MPa，溫度為121℃，滅菌30分鐘，制得營養瓊脂培養基，備用；

2）在無菌條件下，將步驟1）中每一個滅菌后的營養瓊脂培養基中加入100mL的去離子水，然后將營養瓊脂培養基攪碎至粒徑為0.5--0.8cm的顆粒時止，混合均勻，形成水-瓊脂混合培養基，備用；

步驟二、玉米苗培養

按重量分數比取1份粒徑為0.8mm的玉米和2份濃度為0.1%的汞，將玉米在汞中浸泡10分鐘，取出，用去離子水洗滌3次，然后將洗滌后的玉米放到底層鋪有無菌濾紙的培養容器中，后在培養容器內加入無菌去離子水，去離子水的加入量淹沒濾紙時止，后將培養容器送入25℃的培養箱內，培養3-4天待玉米發芽后，將玉米芽移植到水-瓊脂混合培養基中，25℃-30℃條件下，見光培養，備用；

步驟三、鐮刀菌接種菌液制備與接種

1）在100mL的去離子水中加入20g的馬鈴薯片，煮20-30分鐘，過濾，得到濾液，后在濾液中加入2g的葡萄糖，混合均勻，然后用去離子水定容至100mL止，制得馬鈴薯液體培養基，備用；

2）在無菌條件下，在馬鈴薯液體培養基中接入一個玉米青枯病原鐮刀菌種，送入搖床上，在25℃條件下，發酵培養培養4-6天，形成玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液，然后在玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液中加入磁力攪拌器，轉速為150轉/分鐘，攪拌160-200分鐘，使整個菌液呈糊狀并能用玻璃吸管定量吸入狀態，后繼續培養24小時，形成鐮刀菌接種菌液，備用；

3）玉米幼苗生長至丙烯膜處，在丙烯膜上開一個玉米生長口，待玉米生長至4-5片葉子時止，在無菌條件下，向培養玉米的三角瓶內加入5-6mL步驟2）中得到的鐮刀菌接種菌液，25-30℃條件下，見光培養10天，得到感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米，備用；

步驟四、對感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米進行檢測

1）取直徑為2cm的感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部，洗凈，然后在研缽內加入取1g感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部、0.5mL的TE溶液、0.5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均勻，得到物料，備用；

2）將步驟1）中得到的物料全部轉入5mL離心管內，在65℃條件下放置10分鐘，后加入600μL濃度為7.5mol/L的乙酸銨溶液，置于0℃條件下，放置8分鐘，取出，將含有物料的5mL離心管送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液Ⅰ，在1.5mL離心管a內加入500μL的上清液Ⅰ、50μL濃度為3mol/L的NaAc和300μL的異丙醇，混合均勻，形成混合液Ⅰ，將含有混合液Ⅰ的1.5mL離心管a置于0℃條件下，放置8分鐘，取出，后將含有混合液Ⅰ的1.5mL離心管a送入離心機內，以轉速為13000轉/分鐘，離心10分鐘，得到1.5mL離心管a底部的沉淀，備用；

3）在含有沉淀的1.5mL離心管a內加入200μL的TE溶液，將沉淀溶解，后加入5μL的RNase酶，混合均勻，后置于65℃條件下，放置10分鐘，再加入200μL的氯仿-異戊醇混合液，混合均勻，形成混合液Ⅱ，將含有形成混合液Ⅱ的1.5mL離心管a送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液，在1.5mL離心管b中加入500μL的上清液Ⅱ、50μL濃度為3mol/L的NaAc和300μL的異丙醇，混合均勻，形成混合液Ⅲ，將含有混合液Ⅲ的1.5mL離心管b送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心10分鐘，得到沉淀，備用；

4）用濃度為70%的乙醇對步驟3）中1.5mL離心管b內的沉淀洗滌1次，待乙醇揮發完畢后，在1.5mL離心管b內加入25μL的TE溶液，混合均勻，形成DNA模板，備用；

5）真菌ITS通用引物

上游引物：5ˊ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ˊ

下游引物：5ˊ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ˊ

6）在0.5ml離心管Ⅰ內加入2μL步驟一中得到的DNA模板、4.0μL的10倍緩沖液、1μL的dNTP、1μL的上游引物、1μL的下游引物、1μL的Taq聚合酶和40.0μL的去離子水，混合均勻，得到混合液Ⅳ，備用；

7）將含有混合液Ⅳ的0.5ml離心管Ⅰ放入基因擴增儀中，進行PCR擴增，PCR擴增程序為：94℃預變性5分鐘，94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環，共35次循環，后72℃再次延伸10分鐘，取出，得到擴增產物，備用；

8）利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，在凝膠成像系統中確認擴增產物中含有551bp的目的條帶，備用；

9）用DNA凝膠回收試劑盒對擴增產物進行回收、純化

取1.5ml離心管c并稱其重量，在紫外燈下將擴增產物從步驟1）中的凝膠上切下，將切下的擴增產物放在已稱重的1.5ml離心管c中，稱取1.5ml離心管c的總重并計算出從凝膠上切下來的擴增產物的重量，然后將1.5ml離心管c中的擴增產物搗碎，按擴增產物的克數加入相同毫升數的DNA純化結合液，混合均勻，將1.5ml離心管c放置在50oC水浴中加熱至擴增產物完全融解，得到混合液Ⅴ，將混合液Ⅴ加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21℃條件下放置1分鐘，將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加入700微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，后將收集管在21℃條件下放置1分鐘，后將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，將DNA純化柱置于收集管內，然后將收集管放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱放置于1.5ml離心管d中，后在DNA純化柱上加入40微升洗脫液，將1.5ml離心管d在21℃條件下放置1分鐘，然后將收集管放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱得到1.5ml離心管中d中的液體，備用；

10）將步驟9）中回收、純化后的液體進行測序，并在Genbank進行比對，確定為玉米青枯病原鐮刀菌，即玉米上感染玉米青枯病原鐮刀菌；

所述的DNA純化結合液的組成成份：每升DNA純化結合液中含有25mmol的葡萄糖、10mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；

所述的洗滌液的組成成份：按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；

所述的洗脫液的組成成份：每升洗脫液中含50mmol的三羥甲基氨基甲烷、10mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；

所述的SDS裂解液的組成成份：每升SDS裂解液中含有50mM的三羥甲基氨基甲烷和10g的十二烷基硫酸鈉，余量為水；

所述的氯仿和異戊醇混合液的組成成分：按體積比氯仿和異戊醇混合液中含有24份的氯仿和1份的戊醇；

所述的TE溶液的組成成份：每升TE溶液中含有10mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、1mmol的乙二胺四乙酸，余量為水。