[發明專利]一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法

無效

• 申請號: 201210009628.9
• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN102533568A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 侯軍;林曉民;陳跟強;胡梅;孫亞莉
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12R1/645
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 苗強

技術領域

本發明涉及一種分離方法，具體的說是一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法。

背景技術

玉米青枯病是世界玉米產區普遍發生的一種土傳病害。在我國各地的玉米產區也相繼發生且比較嚴重，從而嚴重影響玉米的產量，一般玉米青枯病的發病率為10%-20%，多雨季節發病嚴重，最高可達80%以上。一般情況下按病情發展速度和田間癥狀可分為急性型和普通型。急性型多發生在玉米生長后期乍雨乍晴的天氣，又稱青枯型，發病速度快，通常在1-2天內全株迅速失水枯萎，似開水燙，呈灰綠色青枯狀，莖基部可見維管束已變褐色，最后導致水漬狀壞死，果穗下垂。普通型多在連續陰雨的天氣發生，又稱黃枯型，病情發展較慢，一般在5-10天全株才表現癥狀，整株葉片自下端開始依次黃枯，有時也呈現水燙狀青黃枯，莖基初呈褐色水漬狀斑，表皮失水輕微皺縮，進而變軟成條紋凹陷，嚴重者葉片全部黃枯，根壞死，果穗下垂，莖基髓部中空，極易倒伏。

玉米青枯病是一種典型的土傳病害，且為多種病菌侵染所致，其病原菌又為多寄主和半腐生性，病原菌在土壤、肥料、病株殘體和種子上越冬。目前對于玉米青枯病病原菌的分離尚不完善，沒有可行的分離方法。

發明內容

本發明針對上述問題的不足，提供一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，利用分離玉米青枯病原腐霉菌培養基將玉米青枯病原腐霉菌種進行分離，其分離方法簡單。

本發明涉及的試劑：DNA凝膠回收試劑盒購買于碧云天生物技術研究所，該試劑盒中自配有成品的DNA純化結合液，洗滌液，洗脫液，DNA純化柱，收集管；

本發明為解決上述問題所采用的技術方案是：一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，分離玉米青枯病原腐霉菌所用的分離培養基的原料由瓊脂、葡萄糖、馬鈴薯、酵母浸膏和復合抗生素母液組成，各原料的加入量是：15—30g的瓊脂、15—30g的葡萄糖、150—300g的馬鈴薯、0.8—1.5g的酵母浸膏和0.4—0.7mL的復合抗生素母液；

利用分離培養基分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步驟為：

步驟一、抗生素培養基的配制

1）在濃度為80萬U/瓶的青霉素鈉中加入無菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20萬U/mL的母液a，備用；

2）在濃度為100萬U/瓶的硫酸鏈霉素中加入無菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20萬U/mL的母液b，備用；

3）按重量份數比取1份的濃度為20萬U/mL的母液a和1份的濃度為20萬U/mL的母液b，混合均勻，制得濃度為10萬U/mL的復合抗生素母液，備用；

步驟4）在4000mL的水中加入400-600g的馬鈴薯，煮30—40分鐘，過濾，得到馬鈴薯濾液，備用；

步驟5）在1500mL的馬鈴薯濾液中加入15—30g的瓊脂、15—30g的葡萄糖和0.8—1.5g的酵母浸膏，加熱至80—90℃，使瓊脂溶解，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基煮至1000mL時，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基分裝于10個三角瓶中，每瓶100mL，后將每個三角瓶放入高壓滅菌鍋內，在壓強為1.05kg/cm²，溫度為121℃，滅菌40分鐘，取出，后在21℃條件下冷卻至60℃止，在每個含有酵母浸膏馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的三角瓶內加入0.4—0.7mL步驟3）中得到的復合抗生素母液，混合均勻，使每個三角瓶內的抗生素濃度為20U/mL，制得抗生素培養基，后將抗生素培養基倒入無菌培養皿內，每個培養皿內抗生素培養基的含量為30mL，放置40分鐘，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板，備用；

步驟6）取步驟4）中得到的1000mL馬鈴薯濾液，在濾液中加入15—30g的瓊脂、15—30g的葡萄糖，0.8—1.5g的酵母浸膏，加熱至80—90℃，使瓊脂溶解，后將溶液定容至1000mL，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基分裝于10個三角瓶中，每瓶100mL，然后將每個三角瓶放入高壓滅菌鍋內，在壓強為1.05kg/cm²，溫度為121℃，滅菌40分鐘，取出，后在21℃條件下冷卻至60℃止，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基倒入無菌培養皿內，每個培養皿內含有30mL的培養基，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板，備用；

步驟二、病原菌的萌發

1）將含有病原菌的玉米桿，剝離葉片，用保鮮膜將玉米桿包裝好并放于10℃條件下，放置3天。