[發明專利]一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法

無效

• 申請號: 201210009628.9
• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN102533568A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 侯軍;林曉民;陳跟強;胡梅;孫亞莉
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12R1/645
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 苗強

1.一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，其特征在于：分離玉米青枯病原腐霉菌所用的分離培養基的原料由瓊脂、葡萄糖、馬鈴薯、酵母浸膏和復合抗生素母液組成，各原料的加入量是：15—30g的瓊脂、15—30g的葡萄糖、150—300g的馬鈴薯、0.8—1.5g的酵母浸膏和0.4—0.7mL的復合抗生素母液；

利用分離培養基分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步驟為：

步驟一、抗生素培養基的配制

1）在濃度為80萬U/瓶的青霉素鈉中加入無菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20萬U/mL的母液a，備用；

2）在濃度為100萬U/瓶的硫酸鏈霉素中加入無菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20萬U/mL的母液b，備用；

3）按重量份數比取1份的濃度為20萬U/mL的母液a和1份的濃度為20萬U/mL的母液b，混合均勻，制得濃度為10萬U/mL的復合抗生素母液，備用；

步驟4）在4000mL的水中加入400-600g的馬鈴薯，煮30—40分鐘，過濾，得到馬鈴薯濾液，備用；

步驟5）在1500mL的馬鈴薯濾液中加入15—30g的瓊脂、15—30g的葡萄糖和0.8—1.5g的酵母浸膏，加熱至80—90℃，使瓊脂溶解，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基煮至1000mL時，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基分裝于10個三角瓶中，每瓶100mL，后將每個三角瓶放入高壓滅菌鍋內，在壓強為1.05kg/cm²，溫度為121℃，滅菌40分鐘，取出，后在21℃條件下冷卻至60℃止，在每個含有酵母浸膏馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的三角瓶內加入0.4—0.7mL步驟3）中得到的復合抗生素母液，混合均勻，使每個三角瓶內的抗生素濃度為20U/mL，制得抗生素培養基，后將抗生素培養基倒入無菌培養皿內，每個培養皿內抗生素培養基的含量為30mL，放置40分鐘，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板，備用；

步驟6）取步驟4）中得到的1000mL馬鈴薯濾液，在濾液中加入15—30g的瓊脂、15—30g的葡萄糖，0.8—1.5g的酵母浸膏，加熱至80—90℃，使瓊脂溶解，后將溶液定容至1000mL，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基分裝于10個三角瓶中，每瓶100mL，然后將每個三角瓶放入高壓滅菌鍋內，在壓強為1.05kg/cm²，溫度為121℃，滅菌40分鐘，取出，后在21℃條件下冷卻至60℃止，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基倒入無菌培養皿內，每個培養皿內含有30mL的培養基，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板，備用；

步驟二、病原菌的萌發

1）將含有病原菌的玉米桿，剝離葉片，用保鮮膜將玉米桿包裝好并放于10℃條件下，放置3天；

2）用75%的酒精將含有病原菌的玉米桿外側消毒，剪成10cm的小段，剖開玉米莖桿，將病變組織暴露，取三個直徑為1cm的病變組織塊，將病變組織塊接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板中，在28℃條件下，培養3-5天，得到萌發后的病原菌，備用；

步驟三、在步驟一中得到的加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板內，接種步驟二中得到的萌發后的病原菌，在28℃條件下，培養3-5天，得到純化后的菌株，備用；

步驟四、依據步驟三的方法，在加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板內接種步驟三得到的純化后的菌株，在28℃條件下，培養3-5天，進一步純化得到玉米青枯病原腐霉菌株，備用；

步驟五、將步驟四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，在28℃條件下，培養6天，得到玉米青枯病原腐霉菌絲，即分離得到玉米青枯病原腐霉菌。