[發(fā)明專利]一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測(cè)細(xì)菌的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210009421.1
• 申請(qǐng)日: 2012-01-12
• 公開（公告）號(hào): CN102590319A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 屈鋒;孟朝陽;梅芳;古力
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京理工大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/447
• 分類號(hào): G01N27/447;G01N21/33;G01N21/64
• 代理公司: 北京理工大學(xué)專利中心 11120
• 代理人: 楊志兵;張利萍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測(cè)細(xì)菌的方法，具體地說，涉及一種應(yīng)用毛細(xì)管電泳檢測(cè)原生質(zhì)體與單鏈DNA(single-stranded?DNA，ssDNA)或藥物的相互作用，實(shí)現(xiàn)ssDNA或藥物對(duì)原生質(zhì)體的識(shí)別，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)，屬于生物分析領(lǐng)域。

背景技術(shù)

目前，微生物檢測(cè)分析的方法主要有生理生化鑒定、氣相色譜、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、傅里葉變換紅外光譜、三維熒光光譜以及毛細(xì)管電泳等方法。

其中，毛細(xì)管電泳(capillary?electrophoresis，CE)，又稱高效毛細(xì)管電泳(highperformance?capillary?electrophoresis，HPCE)，是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以樣品的多種特性，如電荷、大小、等電點(diǎn)、極性、親和行為以及相分配特性等為根據(jù)的液相微分離分析技術(shù)。毛細(xì)管電泳的工作原理為：某物質(zhì)在受到其它物質(zhì)的各種作用，包括化學(xué)、物理和生物的作用后，該物質(zhì)自身的荷電情況、幾何尺寸、構(gòu)型及具有原性質(zhì)形態(tài)的濃度等性質(zhì)將發(fā)生改變。在毛細(xì)管電泳譜圖中，所述改變表現(xiàn)為該物質(zhì)的遷移時(shí)間、峰高、峰面積的改變。

CE是分析科學(xué)中繼高效液相色譜之后的又一重大進(jìn)展，它使分析科學(xué)得以從微升水平加入納升水平，并使單細(xì)胞分析，乃至單分子分析成為可能，生物大分子如蛋白質(zhì)的分離分析也因此有了新的轉(zhuǎn)機(jī)。毛細(xì)管電泳具備以下優(yōu)點(diǎn)：

高效，自由溶液CE的效率在105～106理論塔板之間；

快速，幾十秒至十幾分鐘完成分離；

微量，進(jìn)樣所需的樣品體積可小到1uL，試劑消耗體積在1～50nL；

多模式，僅需一臺(tái)儀器就可根據(jù)需要選用不同的分離模式；

樣品對(duì)象廣，可從無機(jī)離子到整個(gè)細(xì)胞，具有很強(qiáng)的分析功能和潛力；

自動(dòng)，通常使用水溶液，對(duì)人對(duì)環(huán)境無害，實(shí)屬“綠色”分析技術(shù)。

目前，CE已成為重要的分離技術(shù)，在生物、醫(yī)藥以及化工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

基于小分子與微生物的相互作用對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)，目前已有關(guān)于核酸分子與微生物發(fā)生相互作用識(shí)別檢測(cè)微生物的報(bào)道，但能夠與核酸分子發(fā)生相互作用的微生物非常少，因?yàn)槲⑸锏募?xì)胞壁具有強(qiáng)屏蔽作用，使微生物能與核酸分子相互作用的位點(diǎn)非常少，即使有相互作用的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的相互作用力也非常微弱，所以大大限制了利用小分子與微生物的相互作用以識(shí)別檢測(cè)微生物的準(zhǔn)確率和應(yīng)用范圍。

原生質(zhì)體指在人為條件下，去除原有細(xì)胞壁或抑制新生細(xì)胞壁后所得到的僅有一層細(xì)胞膜包裹著的圓球狀對(duì)滲透敏感的細(xì)菌。現(xiàn)有技術(shù)中主要是通過酶法去掉細(xì)菌的細(xì)胞壁制備得到原生質(zhì)體，由不同細(xì)菌制備的原生質(zhì)體具有該細(xì)菌的特性，原生質(zhì)體在適宜條件下可生長(zhǎng)繁殖形成與原細(xì)菌生物活性基本相同的細(xì)菌，因此對(duì)原生質(zhì)體的識(shí)別即等同于對(duì)原生質(zhì)體所屬細(xì)菌的識(shí)別。研究ssDNA或藥物對(duì)原生質(zhì)體的識(shí)別，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)細(xì)菌的檢測(cè)，具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值，目前還未見有關(guān)于應(yīng)用毛細(xì)管電泳檢測(cè)原生質(zhì)體與ssDNA或藥物的相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌檢測(cè)的方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

為實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、低成本地檢測(cè)細(xì)菌，本發(fā)明的目的在于提供一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測(cè)細(xì)菌的方法，所述方法應(yīng)用毛細(xì)管電泳檢測(cè)原生質(zhì)體與ssDNA或藥物的相互作用，實(shí)現(xiàn)ssDNA或藥物對(duì)原生質(zhì)體的識(shí)別，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)；可克服現(xiàn)有核酸分子與微生物發(fā)生相互作用識(shí)別檢測(cè)微生物的方法中存在的相互作用位點(diǎn)少以及相互作用力弱的缺陷，具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便以及成本低特點(diǎn)。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測(cè)細(xì)菌的方法，所述方法步驟如下：

(1)制備原生質(zhì)體

采用生物領(lǐng)域中制備細(xì)菌原生質(zhì)體的常規(guī)技術(shù)手段進(jìn)行制備。

(2)毛細(xì)管電泳檢測(cè)用樣品配制

將待檢測(cè)的細(xì)菌原生質(zhì)體和與所述原生質(zhì)體相互作用的ssDNA或藥物采用毛細(xì)管電泳緩沖液配制成樣品，樣品中，原生質(zhì)體懸液的濃度為10⁵～10⁹CFU/mL，ssDNA溶液的濃度為2～20μM，藥物溶液的濃度為0.5～10mmol/L。

(3)毛細(xì)管電泳檢測(cè)樣品

將步驟(2)制備得到的樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，所述毛細(xì)管電泳為常規(guī)毛細(xì)管電泳技術(shù)。