[發明專利]一種梅花鹿朊蛋白免疫學檢測方法

無效

• 申請號: 201210009078.0
• 申請日: 2012-01-12
• 公開（公告）號: CN102565410A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 盧士英;柳增善;任洪林;李巖松;周玉;劉東;宋杰;張茂林;李兆輝
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

技術領域

本發明屬生物檢驗檢疫領域，通過構建重組蛋白，利用重組蛋白免疫動物制備抗體，建立一種梅花鹿朊蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法。?

背景技術

朊病毒（Prion）是一種由蛋白質組成而不含有核酸等遺傳物質的病毒。朊病毒(PrP^sc)是生物體內普遍存在的正常細胞型朊蛋白（PrP^c），當它由于某種原因結構發生變化，在細胞內發生錯誤折疊并可以抵抗新陳代謝，進而聚集擴增，最后引起細胞死亡，最終引起宿主發生神經退行性病變，導致不可逆轉性死亡。?

朊病毒病作為一種新型疾病，由于它病原的特異性，傳統的消毒措施不能破壞它的傳染性，正常的食物加工過程中不能有效滅活朊病毒，因此該病對食品安全造成巨大威脅。當瘋牛病在歐洲爆發時，英法等國屠宰牛群達到100萬只以上，造成巨大的經濟損失，同時許多人因為使用了病牛肉制品可能在今后的幾十年后感染朊病毒病。?

鹿慢性消耗性疾病（Chronic?wasting?disease,CWD）和瘋牛病（BSE），羊癢疫(Scrapy)，人克雅氏病(CJD)一樣都屬于朊病毒病。鹿慢性消耗性疾病主要感染北美麋鹿、黑尾鹿、白尾鹿等，廣泛分布于北美，主要存在于加拿大和美國。近幾年，亞洲國家韓國在引進來自加拿大的鹿體內發現朊病毒，后證實病鹿感染鹿慢性消耗性疾病。?

梅花鹿是我國重要經濟動物，梅花鹿制品品種豐富，具有較高的藥用價值和經濟價值。由于PrP^sc可以吸引PrP^c,并將其轉化成PrP^sc導致疾病的傳播，而且朊蛋白在各個物種中均高度保守，梅花鹿朊蛋白和北美麋鹿、黑尾鹿、白尾鹿氨基酸同源性則高達93%。一旦該病在我國出現，必將對我國的財政收入、食品安全造成巨大的危害。?

當前對于朊病毒病的檢測主要是利用PrP^sc抗蛋白酶消化的特點，對動物組織勻漿進行消化前后的對比，既可以判斷該病原是否存在。檢測手段主要應用Western?blot和免疫組化的方法。這兩種方法雖然準確度高，但對儀器和環境的要求很高，需要在實驗室進行。?

發明內容

本發明提供一種梅花鹿朊蛋白免疫學檢測方法，本發明采取的技術方案是包括下列步驟：?

（一）、鼠抗重組朊蛋白PrP^res單克隆抗體的制備如下：

（a）、重組朊蛋白PrP^res的制備：

（1）制備重組朊蛋白PrP^res基因的人工合成引物為：

???????FW:?GGG?AAT?TCC?ATA?TGA?AGA?AGC?GAC?CAA?AAC?CTG；

???????RV:?CGGATC?CGA?ACT?TGC?CCC?TCG?TTG?GTA；

（2）提取梅花鹿總基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲得目的基因，克隆至PMD-18T-Simple載體上，將PrP^res基因片段插入表達載體pET-Trx中構建重組表達質粒，pET-Trx-?PrP^res；?將PrP^res基因片段插入表達載體pET-His中構建重組表達質粒，pET-His-?PrP^res；

（3）將重組表達質粒pET-Trx-?PrP^res和pET-His-?PrP^res轉入BL21(DE3)中進行表達，得到兩種重組融合朊蛋白PrP^res-Trx和PrP^res-His，表達條件為陽性克隆培養物以1%接種于LB培養基（50mg/L抗生素），37℃劇烈搖蕩培養至OD600=0.6時加入終濃度為1mmol/L的IPTG進行誘導，220r/min劇烈搖培4h，離心收集菌體，菌體重新PBS懸浮并經超聲波裂解，離心分別收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE分別檢測全菌、上清和沉淀，發現PrP^res-Trx和PrP^res-His分別以包涵體的形式大量表達；