[發明專利]一種梅花鹿朊蛋白免疫學檢測方法

無效

• 申請號: 201210009078.0
• 申請日: 2012-01-12
• 公開（公告）號: CN102565410A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 盧士英;柳增善;任洪林;李巖松;周玉;劉東;宋杰;張茂林;李兆輝
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

1.?一種梅花鹿朊蛋白免疫學檢測方法，其特下在于包括下列步驟：

（一）、鼠抗重組朊蛋白PrP^res單克隆抗體的制備如下：

（a）、重組朊蛋白PrP^res的制備：

（1）制備重組朊蛋白PrP^res基因的人工合成引物為：

???????FW:?GGG?AAT?TCC?ATA?TGA?AGA?AGC?GAC?CAA?AAC?CTG；

???????RV:?CGGATC?CGA?ACT?TGC?CCC?TCG?TTG?GTA；

（2）提取梅花鹿總基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲得目的基因，克隆至PMD-18T-Simple載體上，將PrP^res基因片段插入表達載體pET-Trx中構建重組表達質粒，pET-Trx-?PrP^res；?將PrP^res基因片段插入表達載體pET-His中構建重組表達質粒，pET-His-?PrP^res；

（3）將重組表達質粒pET-Trx-?PrP^res和pET-His-?PrP^res轉入BL21(DE3)中進行表達，得到兩種重組融合朊蛋白PrP^res-Trx和PrP^res-His，表達條件為陽性克隆培養物以1%接種于LB培養基（50mg/L抗生素），37℃劇烈搖蕩培養至OD600=0.6時加入終濃度為1mmol/L的IPTG進行誘導，220r/min劇烈搖培4h，離心收集菌體，菌體重新PBS懸浮并經超聲波裂解，離心分別收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE分別檢測全菌、上清和沉淀，發現PrP^res-Trx和PrP^res-His分別以包涵體的形式大量表達；

（4）切膠純化方法，取500?μL包涵體提取液處理后不插樣品梳直接上樣，?按常規方法進行SDS-PAGE，將膠浸入2?mol/L?NaAc溶液中在搖床上染色1?h，?將染成銀白色的含目的蛋白膠切割下來，?置于蒸餾水中在脫色搖床上搖?20?min，?脫去NaAc，之后將切下來的膠放在密封透析袋內，以電泳的方法使目的蛋白游離出來，將透析袋中的凝膠取出后，用PEG20000進行濃縮，做透析去除小分子，經SDS-PAGE和Western?blot鑒定后分裝后放入-80度冰箱備用；

(b)?鼠抗重組朊蛋白PrP^res單克隆抗體的制備：

（1）動物免疫

以復性的重組朊蛋白PrP^res-Trx免疫8?周齡Balb/c雌性小鼠,?100μg/只,皮下分點注射，首次免疫用弗氏完全佐劑（1:1）乳化抗原,?間隔3?周后,采用弗氏不完全佐劑（1:1）乳化抗原,?進行第?2、3?次免疫，最后加強免疫時,直接用免疫原進行腹腔注射；

（2）間接ELISA?篩選方法以及陽性雜交瘤判斷標準的建立

分別以重組成熟朊蛋白PrP^res-His和空載體菌體蛋白pET-His包被酶標板孔,以測定PrP^res-Trx免疫血清效價，以未免疫的小鼠血清和SP2/0細胞上清為陰性對照，分別測定492?nm?光吸收值，經過多次ELISA檢測，確定最佳工作條件為：抗原的最適合包被濃度為25μg/ml，4℃包被過夜；陽性和陰性血清最佳工作濃度為1:800，37℃孵育1h；?HRP二抗最佳工作濃度為1:4000，37℃孵育1h，以此建立了間接ELISA篩選方法；

（3）陽性雜交瘤細胞株的建立和穩定性檢測

取加強免疫3d?后的小鼠脾細胞與SP2/0?細胞以5︰1?在PEG1500?的作用下融合,?以建立的間接ELISA?方法篩選出陽性雜交瘤細胞株，通過多次克隆化和篩選后，獲得一株能分泌單克隆抗體的為“3C6”，?其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC?No.5556，分類命名：產朊蛋白單克隆抗體細胞株，并用間接ELISA?法檢測連續培養30?代以及凍存5?個月復蘇后的陽性雜交瘤細胞的上清液，確定其分泌抗體的穩定性；

（4）單克隆抗體生物學特性的鑒定

按試劑盒說明書操作，經鑒定該單克隆抗體為?IgG2b型，以10%的梅花鹿腦勻漿包被Elisa板，以3C6純化后單抗（1μg/ml）檢測，同時以SP2/0細胞上清和鼠陰性血清為陰性對照，在492nm下讀值，3C6反應孔與陰性孔P/N在12800倍稀釋條件下仍大于2，說明該單克隆抗體具有識別天然結構梅花鹿朊蛋白的能力；

（二）、兔抗重組朊蛋白PrP^res-His多克隆抗體的制備：

????用重組朊蛋白PrP^res-His免疫雌性家兔，皮下3點注射，免疫劑量1mg/只/次，間隔14d免疫，共免疫3次，第1次采用弗氏完全佐劑，第2、3次采用弗氏不完全佐劑，第3次免疫后14天心臟放血，37℃放置1小時后，4℃過夜，次日3000轉離心15分鐘，去上清，辛酸-硫酸銨法純化兔多抗血清，純化后的IgG用PBS透析3次，用BCA法測定蛋白濃度，-80℃凍存；

（三）梅花鹿朊蛋白的檢測步驟如下：

(1)加入100μL濃度為5μg/ml兔抗重組梅花鹿朊蛋白PrP^res-His多克隆抗體包被ELISA反應板，4℃孵育12小時；

(2)取梅花鹿腦組織0.5g,加入4.5ml組織蛋白裂解液，制備成10%組織勻漿，每1毫升組織勻漿加入10mg蛋白酶K，37℃孵育1小時；

(3)取出包被后的ELISA板用TBST洗5次，每次5分鐘；

(4)每孔加入300μL封閉液：3%BSA＋3%明膠，37℃孵育2小時；

(5)用TBST洗5次，每次5分鐘；

(6)每孔加入100μL待檢組織勻漿，37℃孵育1小時；

(7)用TBST洗5次，每次5分鐘；

(8)每孔加入100μL濃度為1.25μg/ml辣根過氧化物酶標記的鼠抗重組梅花鹿朊蛋白單克隆抗體3C6，?37℃孵育1小時；

(9)用TBST洗5次，每次5分鐘；

(10)加入底物，37℃避光孵育10分鐘；

(11)每孔加入50μL?2M硫酸終止反應；

(12)讀板，記錄OD值；

(13)根據標準曲線，計算組織勻漿中梅花鹿朊蛋白的含量。