[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210008327.4
• 申請(qǐng)日: 2012-01-12
• 公開（公告）號(hào): CN102586303A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 俞曉平;葉子弘;崔海峰;付賢樹;金榮愉;趙煦泓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)計(jì)量學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，及其在定性檢測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因農(nóng)作物及定量檢測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因水稻轉(zhuǎn)基因含量上的應(yīng)用，以及利用該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因水稻的轉(zhuǎn)基因含量進(jìn)行檢測(cè)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。

(二)背景技術(shù)

Bt基因是蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，Bt)晶體蛋白基因的簡(jiǎn)稱。1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一個(gè)編碼Bt殺蟲晶體蛋白基因，揭開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。Bt基因中分為Cry和Cyt二大類。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道的Bt達(dá)到476種，其中Cry分為58群、449種，Cyt分為2群、27種(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html)。經(jīng)過密碼子優(yōu)化的Bt基因已被成功地導(dǎo)入煙草、玉米、棉花等多種植物，獲得一大批具良好抗蟲性的轉(zhuǎn)基因植物品種和種質(zhì)資源，Bt基因已成為植物基因工程及轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用最廣泛、最具潛力和應(yīng)用前景的抗蟲基因。

目前全世界已獲得了50多種轉(zhuǎn)Bt殺蟲晶體蛋白基因植物，其中水稻、玉米、棉花、馬鈴薯、油菜、楊樹、煙草等已商品化，我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2009年批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的生物安全證書。自1996年首例轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用以來，全球轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究與應(yīng)用產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。截至2010年底，已有25個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)了24種轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化應(yīng)用。以轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米、油菜為代表的轉(zhuǎn)基因作物種植面積由1996年的170萬公頃發(fā)展到2010年的14800萬公頃，14年間增長(zhǎng)了87倍。

SPS(sucrose?phosphate?synthase)基因是水稻中的單拷貝基因，其核苷酸序列不僅具備種內(nèi)一致性，即所有水稻品種中含有SPS基因；還具備種間特異性，即在除水稻外其它物種里沒有該基因DNA片段；可作為轉(zhuǎn)基因水稻熒光定量PCR定量分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。

近年來，關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物的安全性事件報(bào)道不斷，如1996年巴西豆過敏事件、1998年P(guān)usztai事件、1999年美國(guó)大斑蝶事件和墨西哥玉米污染事件、2000年星聯(lián)Bt玉米事件、2007年印度轉(zhuǎn)基因抗蟲棉事件、加拿大超級(jí)雜草事件和中國(guó)抗蟲棉事件等，這些事件促使國(guó)際組織和國(guó)家紛紛制定相應(yīng)的安全管理法規(guī)，加強(qiáng)遺傳改良作物的規(guī)范管理，并對(duì)遺傳改良植物及其產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識(shí)制度。

為了應(yīng)對(duì)遺傳改良作物管理相關(guān)的法律法規(guī)和制度，有必要建立一套高效、快速、特異的檢測(cè)技術(shù)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)無疑是最佳選擇。在實(shí)際檢測(cè)中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)十分關(guān)鍵。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的概念由日本科學(xué)家Kuribara等在2002年提出，它是指一種含有轉(zhuǎn)基因檢測(cè)目的外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性片段的線性化重組質(zhì)粒分子。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，不管是由單一特異性外源序列還是多段目標(biāo)序列構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，都能很好的達(dá)到轉(zhuǎn)基因作物定量分析檢測(cè)，特別是定量PCR檢測(cè)的目的。

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子由于生產(chǎn)方便、易擴(kuò)增、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、純度較高、高效經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)愈來愈受全世界轉(zhuǎn)基因檢測(cè)專家和研究者們重視，在轉(zhuǎn)基因生物鑒定檢測(cè)中是很好的標(biāo)準(zhǔn)陽性物質(zhì)替代物，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因品系以及其加工品的定量PCR檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子在轉(zhuǎn)基因作物和附屬產(chǎn)品檢測(cè)鑒定中的應(yīng)用將會(huì)發(fā)揮越來越重要的作用。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，解決轉(zhuǎn)Bt基因水稻和轉(zhuǎn)Bt基因農(nóng)作物檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題，提供一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的轉(zhuǎn)基因Bt農(nóng)作物尤其是轉(zhuǎn)Bt基因水稻的檢測(cè)方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，由SEQ?ID?No.1(174bp)所示核苷酸片段與SEQ?ID?No.2(81bp)所示核苷酸片段經(jīng)過拼接后，加入常見的酶切位點(diǎn)，插入常規(guī)克隆載體(如pEASY-T3、PMD18-T、PMD19-T等)制得。加入常見的酶切位點(diǎn)Pst?I、Nde?I和Sal?I制得。

具體的，所述的轉(zhuǎn)Bt基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，由SEQ?ID?No.3所示核苷酸片段插入pEASY-T3載體制得，以下簡(jiǎn)稱273號(hào)質(zhì)粒。所述SEQ?ID?No.3核苷酸片段由SEQ?IDNo.1片段與SEQ?ID?No.2片段經(jīng)過拼接后，在插入片段兩端加入常見的酶切位點(diǎn)為Pst?I、Nde?I，在SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2之間加入酶切位點(diǎn)Sal?I得到。

所述273號(hào)質(zhì)粒由如下方法構(gòu)建：

1.設(shè)計(jì)PCR特異性引物；

2.PCR擴(kuò)增；