[發(fā)明專利]一種體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞高表達Nurr1基因的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210008088.2
• 申請日: 2012-01-12
• 公開（公告）號: CN102586183A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝姜;劉擁軍;朱德琳;趙雅寧
• 申請（專利權(quán)）人: 天津和澤干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種干細胞誘導(dǎo)方法，具體地說是一種體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞高表達多巴胺能神經(jīng)元成熟所必須的Nurr1基因的方法。

背景技術(shù)

Nurr1基因（Nuclear?related?factor?1）又稱之為NOT/TINUR/RNR-1/HZF-3,作為即早基因產(chǎn)物，屬于孤兒核受體超家族。Nurr1蛋白幾乎完全集中表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，與神經(jīng)干細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化及多巴胺能神經(jīng)元生存和發(fā)展關(guān)系密切。研究表明，Nurr1蛋白能夠通過多種途徑激活酪氨酸羥化酶（Tyrosine?Hydroxylase,?TH）啟動子，促進TH的表達。此外，還影響多巴胺能神經(jīng)元代謝，促進中腦多巴胺能神經(jīng)元前體細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化，并在分化的維持及晚期分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起決定性作用。

帕金森（PD）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病。其基本的病理改變是特異性的中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的漸進性變性壞死，致使紋狀體內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)減少，引起錐體外系的功能失調(diào)，從而產(chǎn)生靜止性震顫、肌肉強直等一系列運動障礙癥狀。目前，臨床上尚無有效的治療PD的方法。理論上講，細胞移植替代治療是最為理想的治療途徑。目前，體外獲得的多巴胺能神經(jīng)元多由胚胎干細胞（ESCs）或神經(jīng)干細胞（NSCs）誘導(dǎo)分化而成。但是倫理學(xué)、安全性問題以及細胞來源和數(shù)量的有限，在一定程度上都限制了其未來的的臨床移植應(yīng)用。有研究表明，在多因子誘導(dǎo)條件下可將來源更為豐富的間充質(zhì)干細胞可誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元，但陽性率較低。為了進一步提高陽性率，目前，國內(nèi)主要采用Nurr1基因修飾間充質(zhì)干細胞的方法來提高Nurr1基因的表達，使其更易向多巴胺能神經(jīng)元分化。但對于未來的臨床應(yīng)用，基因修飾方法也存在一定的風險。如何通過非基因修飾的方法使得間充質(zhì)干細胞自身高表達Nurr1基因，是目前急需解決的重要課題。

此外，國內(nèi)目前研究向多巴胺能神經(jīng)元分化的間充質(zhì)干細胞多來自骨髓、臍血等。與之相比，臍帶源的間充質(zhì)干細胞（umbilical?cord?mesenchymal?stem?cell，UC-MSCs）取材更為方便、體外擴增能力更強且免疫原性低。在短時間內(nèi)即可獲得數(shù)量充足、安全而且適于移植應(yīng)用的細胞，是未來臨床應(yīng)用更為理想的種子細胞。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞高表達Nurr1基因的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞高表達Nurr1基因的方法，在添加了維甲酸?(RA)、環(huán)化腺核苷一磷酸?(CAMP)和Sonic?Hedgehog(SHH)的DMEM/F-12培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞高表達Nurr1基因。

所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于：DMEM/F-12培養(yǎng)體系添加的RA為10^-6?M～10^-4?M?、CAMP為0.5?mM～2?mM和SHH為200?ng/mL～750?ng/mL。

所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于:上述的培養(yǎng)體系添加的RA的優(yōu)選量為10^-5M，CAMP的優(yōu)選量為1?mM和SHH的優(yōu)選量為500?ng/mL。

具體包括以下步驟：

1）取2～8代人臍帶間充質(zhì)干細胞，當細胞貼壁生長至80%～90%融合時，吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)原有培養(yǎng)液，取5～10?mL?0.01M磷酸緩沖液PBS輕輕加入T₇₅培養(yǎng)瓶內(nèi)洗滌，棄去洗液；

2）加入(質(zhì)量/體積比)0.25%胰蛋白酶-0.01%乙二胺四乙酸EDTA消化液1.0?mL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細胞呈圓形漂起時，加入1.0?mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；

3）加入20?mL?0.01?M?PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下1000?轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；棄去上清液后，加入10?mL?DMEM/F-12重懸細胞，在T₂₅培養(yǎng)瓶中接種5×10⁵個人臍帶間充質(zhì)干細胞；

4）培養(yǎng)體系為含體積比濃度為5%?胎牛血清，100?u/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素的DMEM/F-12完全培養(yǎng)液，添加了10^-5?M?RA、1?mM?CAMP和500?ng/mL?SHH，總體積為5?mL/瓶，置37??C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4天。