[發明專利]檢測膜通道蛋白與靶向藥物的相互作用的方法及其應用

無效

• 申請號: 201210008055.8
• 申請日: 2012-01-12
• 公開（公告）號: CN102565006A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 吉永華;葉品;董邦乾;馮興華;楊宏天
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: G01N21/55
• 分類號: G01N21/55;C07K7/08;C07K14/00
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 陸聰明

技術領域

本發明涉及一種檢測膜通道蛋白與靶向藥物的相互作用的方法及其應用。

技術背景

細胞電壓門控鈉通道（VGSCs）在神經元和其他可興奮性細胞動作電位形成和傳導過程中有非常重要的作用，其細微變化或表達異常都會導致功能改變，是導致癲癇、疼痛、先天性肌肉強直癥、周期性癱瘓等各種疾病的關鍵因素，一直是研究的熱點。但是在長期的進化和演變中，鈉通道形成了一系列亞型，廣泛分布在生物體各個組織中。其亞型的多樣性使得研究過程中針對亞型的區分和鑒定尤為重要，而特異性通道靶向藥物則成為不可或缺的工具。

鈉通道靶向藥物能夠針對鈉通道不同的亞型，具有各種不同的結合位點和作用方式，使得能夠通過兩者之間相互的結合和作用，成為鈉通道亞型區分和鑒定的探針，同時也是研究鈉通道功能的工具。

BmK?I是由東亞短鉗蝎中提取分離得到的鈉通道特異性靶向藥物，是一個由60-70個氨基酸組成的長鏈肽類，能夠作用于鈉通道，改變鈉通道的電生理特征，顯著延緩其失活過程。其機理是由于：鈉通道由一個形成孔道的功能性α亞基，一個或數個輔助β亞基組成。α亞基是鈉通道行使功能的關鍵亞基，由四個高度同源的結構域（DⅠ-DⅣ）組成，每個結構域含有六個跨膜α螺旋片段（S1-S6）。在其結構上目前已經鑒定了至少七個通道靶向藥物的受體位點。

SPR技術可以觀測生物分子的動態結合，實驗時將一種生物分子固定在特殊的芯片上，利用液體傳送系統將溶解有另一種生物分子的結合緩沖液流經芯片，當溶液中的分子與固定在芯片上的分子相互結合時會改變芯片表明的溶液折射率（Resonance?Unit，RU），折射率的變化與結合在芯片表面的生物分子質量成正比。儀器通過跟蹤檢測折光率的變化，進而分析出生物分子之間結合、解離的整個過程。SPR技術能夠實時檢測生物分子間的相互作用，不必使用任何標記，能夠保證生物分子的天然活性。

全細胞膜片鉗能夠進行單個細胞的電生理記錄，通過給予單個細胞電刺激（一定閾值的電壓或電流刺激），或化學刺激（特異性靶向藥物等）可以記錄到由離子通道開放關閉所引起的電流或電壓信號，這一信號即可反映離子通道的電生理學性質，是研究離子通道性質的重要指標。而膜通道靶向藥物作用于通道之后，可以引起通道電生理學性質的改變，從而為研究離子通道提供依據。

鈉通道作為一個大分子量的膜蛋白（260KD），如何能夠分離純化而不影響其活性，保證其完整的結構，是目前尚未解決的難題，而SPR技術檢測動態結合，往往是需要能夠獲得待研究的生物分子樣本，因此膜通道蛋白分離純化的難題，在某種程度上就制約了它的使用，本發明利用人工合成關鍵結合序列肽鏈的方法，克服了此類限制，并成功驗證了其可行性，使得利用SPR技術?研究膜通道蛋白與其靶向藥物結合成為可能。

發明內容：

本發明的目的之一在于提供一種檢測膜通道蛋白與靶向藥物相互作用的方法。

本發明的目的之二在于提供該檢測方法的應用。

為達到上述目的，本發明采用如下實驗方案：

一種檢測膜通道蛋白與靶向藥物相互作用的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：

a.?根據膜通道蛋白上與其靶向藥物相互作用位點上的關鍵氨基酸序列，合成肽鏈；

b.采用表面等離子共振技術檢測步驟a所得的肽鏈與靶向藥物的相互作用。

上述的膜通道為細胞電壓門控鈉通道，該通道的位點3與其靶向藥物相互作用的關鍵氨基酸序列為DⅣ/S3-S4胞外環，根據該關鍵氨基酸序列設計的兩段肽鏈為：

rNav1.5??SIVGTVLSDIIQKYFFSPTL

rNav1.8??SIGSLLFSAILKSLENYFSPTL；

所述的靶向藥物為鈉通道靶向藥物BmK?I。

上述的步驟b的具體方法為：

a.?靶向藥物的芯片固化：

注入400mM的N-ethy1-N-(dimethylaminepropyl)-carbodiimid和100mM的N-hydroxy-succimide的按1:?1的體積比混合成的混合液，激活CM5傳感器芯片上的偶聯基團-COOH；將靶向藥物以23μg/ml的配置濃度置于pH5.0、10mM醋酸鈉溶液中，取30μl注入芯片；