[發明專利]一種流感病毒疫苗的制備方法

有效

• 申請號: 201210007687.2
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102526720A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 劉坤;王希良;張良艷;姚志東;邢麗
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61P31/16;C12N5/02;C12N5/071
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 史雙元

技術領域

本發明屬于疫苗制備技術領域，具體涉及一種流感病毒疫苗的制備方法。

背景技術

流感病毒感染導致急性呼吸道傳染病-流行性感冒，給人類健康和社會生活造成嚴重危害。流感病毒類型多、變異快，當新亞型病毒出現時，人群特異性免疫往往難以奏效。

接種流行株疫苗是預防流感流行、保護易感人群最經濟、有效的手段。目前獲得批準生產的流感疫苗主要是雞胚來源的滅活疫苗，這種疫苗存在諸多不足，如生產成本高、周期長，過敏反應，雞胚連續傳代可導致病毒抗原性變異，雞胚還存在可能的外源因子的污染等，特別是如果禽流感爆發，雞群大量死亡，雞胚供應及產量會成為瓶頸。因此，世界衛生組織積極推薦各國發展哺乳細胞培養的流感病毒疫苗的制備。

目前，多種哺乳細胞被應用于一些病毒性疫苗的生產，Vero細胞全球公認，MDCK細胞美國、歐洲認可。而MDCK細胞又被公認為是培養流感病毒最合適的細胞系，該細胞比目前所知的其他細胞對流感病毒更敏感，短時間即可獲得較高滴度的病毒，同時保持流感病毒抗原的穩定性，但MDCK細胞對于每年WHO發布的流感疫苗病毒株不是全能的敏感，而使得生產的病毒滴度仍有不確定性已成為疫苗生產的瓶頸。有文獻報道同種哺乳細胞表面存在的流感病毒受體的類型和數量是不同的(Govorkova?EA，Murti?G，Meignier?B，Taisne?C?DE，Webster?RG.African?Green?Monkey?Kidney(Vero)Cells?Provide?an?AlternativeHost?Cell?System?for?Influenza?A?and?B?Viruses.J?Virol，1996，70(8)5519-5524.)，因此，建立細胞單克隆庫，篩選病毒敏感的單克隆株，獲得病毒適應性細胞單克隆，提高病毒產量，可為工業化生產流感疫苗奠定基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種流感病毒疫苗的制備方法，提高流感病毒產量，使其適用于工業化生產。

一種流感病毒疫苗的制備方法，按照如下步驟進行：

(1)哺乳動物細胞單克隆庫的建立

將哺乳動物細胞在培養瓶中培養，待細胞生長至匯合度70-90％，用含EDTA的胰蛋白酶消化并計數，取100個細胞稀釋至20ml細胞培養液中，混勻，接種于96孔板，每孔200μl，置37℃細胞培養箱中培養，待細胞長至40-60％匯合度，消化后轉移至24孔板中繼續培養，每一株單克隆化細胞轉移至一孔，待長至85-95％匯合度后消化、轉移至兩個24孔中繼續培養，待長至85-95％匯合度將細胞進行凍存；

(2)病毒高適應性細胞單克隆株的篩選

取單克隆細胞接種至24孔板，培養過夜，吸棄培養液，PBS洗2-6次，加入流感病毒及TPCK-Trypsin，37℃培養48-90h后測定細胞培養上清中的血凝滴度，血凝滴度大于2⁸為病毒高適應性細胞單克隆株；

(3)優化病毒培養條件

取病毒高適應性細胞單克隆株鋪至24孔板中，培養過夜，分別優化病毒培養的溫度、收獲時間、添加TPCK-Trypsin的量和感染指數MOI，獲得病毒在病毒高適應性細胞單克隆株中最佳生長參數；

(4)在生物反應器中培養病毒高適應性細胞單克隆株，培養48-90h后收集培養液，收集的培養液經超濾膜包濃縮、蔗糖密度梯度離心純化、超離脫糖、滅活，測定血凝素含量后配制成單價或多價流感疫苗。

所述哺乳動物細胞為狗腎細胞MDCK、非洲綠猴腎細胞Vero、PER.C6細胞或人二倍體細胞。

所述流感病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒或具有流感病毒表型的重配病毒株。

所述生物反應器培養病毒高適應性細胞單克隆株的方式為微載體懸浮培養或無載體懸浮培養。

所述微載體懸浮培養中的微載體為葡聚糖微載體，用量為10-20g/L。

本發明的有益效果：本發明通過建立細胞單克隆庫、篩選病毒高適應性細胞單克隆株、應用大規模生物反應器進行大規模細胞培養的方法生產流感病毒疫苗，克服傳統雞胚生產流感疫苗生產成本高、周期長，過敏反應、雞胚連續傳代可導致病毒抗原性變異等缺點，大大提高病毒產量，安全、有效、穩定。

附圖說明

圖1為MDCK單克隆細胞株培養甲型H1N1流感病毒疫苗株的血凝滴度檢測。

圖2為大規模培養的病毒適應性細胞單克隆株在微載體cytodex?3上生長的顯微照片。

圖3為細胞培養的流感病毒純化后的電鏡照片。