[發明專利]一種流感病毒疫苗的制備方法

有效

• 申請號: 201210007687.2
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102526720A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 劉坤;王希良;張良艷;姚志東;邢麗
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61P31/16;C12N5/02;C12N5/071
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 史雙元

1.一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，按照如下步驟進行：

(1)哺乳動物細胞單克隆庫的建立

將哺乳動物細胞在培養瓶中培養，待細胞生長至匯合度70-90％，用含EDTA的胰蛋白酶消化并計數，取100個細胞稀釋至20ml細胞培養液中，混勻，接種于96孔板，每孔200μl，置37℃細胞培養箱中培養，待細胞長至40-60％匯合度，消化后轉移至24孔板中繼續培養，每一株單克隆化細胞轉移至一孔，待長至85-95％匯合度后消化、轉移至兩個24孔中繼續培養，待長至85-95％匯合度將細胞進行凍存；

(2)病毒高適應性細胞單克隆株的篩選

取單克隆細胞接種至24孔板，培養過夜，吸棄培養液，PBS洗2-6次，加入流感病毒及TPCK-Trypsin，37℃培養48-90h后測定細胞培養上清中的血凝滴度，血凝滴度大于2⁸為病毒高適應性細胞單克隆株；

(3)優化病毒培養條件

取病毒高適應性細胞單克隆株鋪至24孔板中，培養過夜，分別優化病毒培養的溫度、收獲時間、添加TPCK-Trypsin的量和感染指數MOI，獲得病毒在病毒高適應性細胞單克隆株中最佳生長參數；

(4)在生物反應器中培養病毒高適應性細胞單克隆株，培養48-90h后收集培養液，收集的培養液經超濾膜包濃縮、蔗糖密度梯度離心純化、超離脫糖、滅活，測定血凝素含量后配制成單價或多價流感疫苗。

2.根據權利要求1所述一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞為狗腎細胞MDCK、非洲綠猴腎細胞Vero、PER.C6細胞或人二倍體細胞。

3.根據權利要求1所述一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述流感病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒或具有流感病毒表型的重配病毒株。

4.根據權利要求1所述一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述生物反應器培養病毒高適應性細胞單克隆株的方式為微載體懸浮培養或無載體懸浮培養。

5.根據權利要求4所述一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述微載體懸浮培養中的微載體為葡聚糖微載體，用量為10-20g/L。