[發明專利]一種尼羅羅非魚精子超低溫保存的方法

無效

• 申請號: 201210007382.1
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102578075A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 柳凌;鄒桂偉;張濤;梁宏偉;張潔明;李忠;郭峰
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院長江水產研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及羅非魚種質資源保存和精子低溫生物學技術領域，更具體涉及一種尼羅羅非魚精子超低溫保存的方法，特別是針對尼羅羅非魚精子進行超低溫保存。

背景技術

羅非魚(Tilapia)為一種中小形魚，被譽為未來動物性蛋白質的主要來源之一。原產于非洲，上世紀70年代被引進到我國，目前已成為我國一個重要的水產養殖品種。隨著我國對羅非魚品種的選育和改良，除最初引進的尼羅羅非魚(O.niloticus)和奧尼亞羅非魚(O.aureus)外，又培育了許多新的品種。如：尼羅羅非魚和奧尼亞羅非魚的雜交后代奧尼羅非魚；通過3系雜交選育的后代尼羅超雄魚；以及由8個品系的尼羅羅非魚經雜交混合選育的吉富羅非魚等。

為了能進一步開展羅非魚的新品種選育，以及羅非魚的人工繁殖，為市場提供更優質的羅非魚新品種和苗種，需要進行羅非魚精子超低溫保存。然而，不同魚類的精子其外形、大小、密度、滲透壓、激活后的壽命以及其它生物學特性都不一樣。因此，不同魚類的精子要求有不同的冷凍方法。尼羅羅非魚精子超低溫冷凍保存方法除了有一般魚類精子冷凍保存所必須的步驟外，還有幾個關鍵步驟。這些關鍵步驟的參數都是由尼羅羅非魚精子的生物學特性決定的。

1.精子的滲透壓不同決定了精子的稀釋液配方就不同。滲透壓過高的稀釋液會使精子在稀釋過程中嚴重脫水，精子內部滲透壓迅速升高，造成精子破裂。滲透壓過低的稀釋液，又會使精子在冷凍過程中不斷被激活，從而導致大量精子死亡。尼羅羅非魚精子的滲透壓在280～285mOsM之間，這就要求尼羅羅非魚的精子稀釋液滲透壓也在這個值的區間，從而確保精子在被稀釋后，即不被激活也不破裂。

2.不同魚類的精子密度不同，決定了在冷凍過程中精子的稀釋比也不盡相同。尼羅羅非魚精液中所含精子的密度一般為1.4～1.8×10⁹個/ml。當對羅非魚精子進行超低溫保存時，含高密度精子的精原液是不能直接進行超低溫冷凍保存的。這是因為在冷凍過程中，當溫度降到0℃～-20℃區間時，被保存的精液中會形成冰晶，冰晶像鋒利的刀一樣刺向四周的精子，將精子刺破。這種在冷凍過程中冰晶對精子的物理損傷將直接導致精子超低溫冷凍保存的失敗。因此，冷凍前必須要對精子進行稀釋。如果稀釋比較低，稀釋不夠，則精子密度仍然過高，精子被刺破的概率也仍然很高。稀釋比過高，則影響了精子保存的總量，精子保存的效率很低，而且還會影響到后期的凍精授精。

3.不同魚類的精子膜通透性也不盡相同。精子膜的通透性決定了精子冷凍前在稀釋液中的最小平衡時間。通透性好的精子平衡時間較短，通透性差的精子平衡時間較長。因此，每一種魚的精子都有一個相對恒定的最小平衡時間。精子在達到最小平衡時間后可以維持一段時間精子活力不衰減。不同的魚類這段時間是不完全相同的，它與精子被激活后的壽命有關。一般來講，當激活液選擇正確時，壽命越長，則這段時間也越長。尼羅羅非魚精子的這段時間在4℃冰箱中可維持1小時40分鐘。超過這段時間，精子就開始呈幾何級數衰減。

4.由于不同魚類精子的大小、形狀不同，導致溫度在精子中的傳導速度和時間也不相同。因此，每種魚精子超低溫保存的降溫程序也不盡相同。尼羅羅非魚精子的降溫程序是經過反復試驗后摸索出來的。

上述因素的綜合效應決定了尼羅羅非魚精子的超低溫冷凍保存必須要有其特定的方法。本發明中的方法是根據尼羅羅非魚精子的生物學特性所設計的，目前已成功的應用到尼羅羅非魚精子的超低溫保存中。

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種尼羅羅非魚精子超低溫保存的方法，方法易行，操作簡便，應用該方法保存尼羅羅非魚精子，可最大限度的提高精子復蘇后的存活率，減少冷凍過程對精子的各種損傷。對尼羅羅非魚精子進行超低溫保存，從而為羅非魚的選育種提供必須的材料和手段。

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施：

一種尼羅羅非魚精子超低溫保存的方法，其步驟是：

(1)尼羅羅非魚精子的采集：選擇性腺發育成熟的尼羅羅非魚雄魚，用干毛巾擦干生殖孔周圍及腹部的水。用手輕輕擠壓雄魚腹部，待能擠出精液后，前面幾滴(3-6)精液不要，然后將精液擠入干燥的容器中，混勻。

(2)精子活力檢測：在10×20倍的顯微鏡下進行鏡檢，計算機輔助檢測鮮精平均活率達到85％以上，平均曲線運動速度(VCL)達到35微米/秒以上，平均直線運動速度達到20微米/秒以上，該精子便可用于超低溫冷凍保存。將鏡檢合格的精子放入4℃冰箱保存備用。