[發(fā)明專利]一種利用轉基因技術獲得高烷烴含量牛角瓜的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210007265.5
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102586271A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設計）人: 趙兵;孫健;王曉東
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C12Q1/68;A01H4/00;A01H5/00;G01N30/02
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技術領域

本發(fā)明涉及一種利用轉基因技術獲得高烷烴含量牛角瓜的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

牛角瓜(Calotropis?gigantea)屬于蘿藦科，直立灌木，可高達3米，全株有乳汁，幼枝被灰白色絨毛。零星分布于我國廣東、廣西、云南、海南等地。其乳汁可提煉樹膠原料，還可制鞣料及黃色染料。莖皮纖維堅韌，可制人造棉、造紙、制繩索、織麻布和麻袋等。種毛可作絲絨原料及填充物。

牛角瓜為傳統(tǒng)藥用植物，在其分布的熱帶和亞熱帶地區(qū)有悠久的藥用歷史。到19世紀80年代科學家在牛角瓜中發(fā)現(xiàn)含有烴類成分，由此牛角瓜作為能源植物逐漸得到重視。在早期對能源植物的篩查過程中發(fā)現(xiàn)牛角瓜可以生產生物原油，其主要成分為碳氫化合物。如果在10000株每公頃的種植密度下，其產量可以達到6.6桶/公頃。這些生物原油經過分析已經證明是和石油主要成分相同的碳氫化合物，而且，這些物質的成分及含量并不隨季節(jié)和土壤條件不同而產生明顯變化。但是牛角瓜中烴類成分含量較低，無法滿足工業(yè)利用的要求，因此提高牛角瓜中烷烴含量成為迫切需求。分子育種由于具有周期短、目標明確等特點，適用于高烷烴含量牛角瓜品種的培育。

目前，生物合成烷烴的代謝途徑的闡明主要來自對蠟質合成的研究結果。蠟質合成的代謝途徑主要包括兩個不同的代謝途徑：乙酰還原途徑和脫羰基途徑(Kunst?L?et?al.Progress?in?Lipid?Research，2003，42，51-80)，其中烷烴就是脫羰基途徑的一個重要的中間代謝產物。經過研究已經發(fā)現(xiàn)一些烷烴合成的關鍵酶，這些酶負責脂肪酸到烷烴的轉化，具體的代謝途徑為脂肪酸在?；鵆oA還原酶的作用下生成脂肪醛，再進一步由脂肪醛脫羰基酶催化形成烷烴。Aarts等(Aarts?et?al.The?Plant?Cell?1995，7，2115-2127)克隆了擬南芥的CER1基因，CER1主要在莖、花和果實中表達，在葉中表達水平較低。CER1蛋白與膜內在蛋白有相似性，是高度疏水性分子。因為CER1突變體中醛大量積累，而烴的含量卻降低，所以推測CER1蛋白為脫羧酶，催化長鏈醛到烴的轉化。Chen等(Chen?X?et?al.The?Plant?Cell，2003，15，1170-1185)從擬南芥中克隆并鑒定了第一個能同時影響上表皮蠟質層和角質膜層組成和結構的基因WAX2，WAX2突變體與野生型相比具有以下變異：角質層較野生型輕20％但厚36％；蠟質組分總量降低78％以上；葉面水分蒸發(fā)顯著增強；對除草劑的耐受力降低。通過對WAX2基因突變體的研究發(fā)現(xiàn)WAX2基因的突變封閉了醛類物質及其代謝物的合成，因此WAX2可能通過影響長鏈乙酰CoA的還原發(fā)揮作用，另外，WAX2突變體的表皮膜的瓦解現(xiàn)象說明WAX2可能在角質合成過程也是必須的基因。Kurata等(Kurata?T?et?al.The?Plant?Journal，2003，36，55-66)隨后也報道了WAX2基因(另命名為YORE-YORE)的克隆與基因表達部位的研究，WAX2(YORE-YORE)只在莖表皮分生組織和嫩葉、莖、果實和根的形成初期的細胞中有特定表達，在生長的表面毛上有高表達，WAX2(YORE-YORE)可能控制從酰基CoA向醛類和角質層組分的轉化。Sturaro等(Sturaro?M?et?al.Plant?physiology，2005，138，478-489)在玉米中克隆了WAX2的同源基因命名為GLOSSY1，該基因與玉米表皮的發(fā)育及蠟質的積累有關。另外，Pierre等(Broun?P?et?al.PNAS，2004，101，4706-4711)在擬南芥中克隆了WIN1基因，研究發(fā)現(xiàn)該基因為一個乙烯誘導的轉錄因子，一些蠟質合成過程中的關鍵基因例如CER1，KCS1和CER2等均受到該基因的控制，利用轉基因技術使該基因在擬南芥中過量表達發(fā)現(xiàn)植物葉表皮蠟質的含量達到對照組的4.5倍，并且烷烴占到其中的85％高于對照組的65％。

本發(fā)明利用發(fā)根農桿菌的介導將烷烴合成過程中涉及的一些關鍵基因轉入牛角瓜中，獲得牛角瓜轉基因毛狀根，經過在芽誘導培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，最終獲得了轉基因牛角瓜，檢測結果表明，本發(fā)明中獲得的轉基因牛角瓜的烷烴含量得到了明顯提高。目前尚未見到有關利用轉基因技術提高牛角瓜烷烴含量的報道。

發(fā)明目的及內容