[發明專利]一種利用轉基因技術獲得高烷烴含量牛角瓜的方法

無效

• 申請號: 201210007265.5
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102586271A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 趙兵;孫健;王曉東
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C12Q1/68;A01H4/00;A01H5/00;G01N30/02
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1.一種利用轉基因技術獲得高烷烴含量牛角瓜的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)烷烴合成過程關鍵基因的克隆；

提取擬南芥總RNA并反轉錄產生cDNA，以cDNA為模板，根據烷烴合成過程關鍵基因的序列設計引物，對其進行PCR擴增，將獲得的目的片段插入T載體，然后進行DNA序列分析；

(2)植物表達載體的構建；

將測序正確的基因用BamH?I和Sac?I從T載體上切下，插入植物表達載體，構建成含外源基因的植物表達載體；

(3)通過發根農桿菌的介導進行植物轉化；

采用凍融法將含外源基因的植物表達載體導入發根農桿菌，涂布在含卡那霉素50mg/L的YEB平板上，在28℃恒溫培養箱中培養2天后，挑取單菌落，用PCR方法進行檢測，檢測為陽性的克隆用于感染牛角瓜無菌苗的葉片；感染后的牛角瓜葉片在黑暗條件下共培養2天，然后轉至含有300mg/L頭孢霉素的MS培養基，25±1℃，16h/8h光/暗培養，每隔2周轉接一次，共轉接3-5次，感染后約3-4周產生毛狀根，待毛狀根長至2-3cm，用PCR方法進行檢測；

(4)轉基因植株再生；

將檢測為陽性的毛狀根切下后轉至芽誘導培養基上進行生芽培養，待獲得的芽長至1-2cm高時，將獲得的再生芽轉入生根培養基，經過2-3周培養，再生芽生根長成完整再生植株；

(5)轉基因植株的檢測和篩選；

對轉基因植株采取三步法篩選，第一步，采用PCR方法擴增轉基因植株的目的基因，檢測外源基因是否轉入；第二步，對PCR檢測為陽性的轉基因株系進行RT-PCR分析，判斷外源基因是否在轉基因植株中表達；第三步，對獲得的陽性轉基因植株進行烷烴含量的分析，篩選高產烷烴的轉基因牛角瓜。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)所述的烷烴合成過程關鍵基因為WAX2、CER1和WIN1中的一種。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的烷烴合成過程關鍵基因的克隆引物是根據Genbank中擬南芥WAX2、CER1和WIN1的mRNA序列進行設計，其序列如表1所示。

表1烷烴合成過程關鍵基因的克隆引物

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟2)所述的植物表達載體為pCAMBIA-1301，該載體多克隆位點的Xba?I和Sal?I之間插入了35S?CAMV啟動子，Sac?I和EcoR?I間插入了NOS終止子。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3)所述的發根農桿菌為ATCC15834。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3)所述的檢測轉基因發根所用的PCR引物如表1所示。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征是：步驟4)所述的芽誘導培養基是MS+0.1mg/L?NAA+0.1mg/L?6-BA或MS+0.5mg/L?NAA+4.0mg/L?6-BA，生根培養基為MS。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟5)所述的轉基因植株PCR和RT-PCR所用的引物如表1所示。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟5)所述的牛角瓜轉基因植株中烷烴的提取及檢測方法如下：

牛角瓜轉基因植株在50℃下干燥至恒重，粉碎后過40目篩，按液固比20∶1向粉碎的樣品中加入正己烷，劇烈混合10min后，5000rpm離心10min進行液固分離，取上層液相到一新容器中；按上述方法重復提取兩次，合并三次正己烷相，50℃減壓蒸餾回收正己烷，膏狀物即為烷烴物質粗提物；得到的烷烴提取物用正己烷溶解后用氣相色譜進行檢測；檢測條件如下：

進樣口：250℃，分流比40∶1

檢測器：350℃

柱溫：升溫速率℃/分?溫度℃?保持時間(分)

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根據樣品中各烷烴色譜峰的保留時間與C₈-C₄₀?alkane?window標準品中各烷烴的保留時間進行比較，確定牛角瓜轉基因植株中烷烴種類；分別利用烷烴標準品建立牛角瓜轉基因植株中含有的各種烷烴的標準曲線，并計算牛角瓜轉基因植株中各種烷烴的含量；牛角瓜轉基因植株中含有的各種烷烴的含量總和即為牛角瓜轉基因植株的烷烴含量。