[發明專利]以適體為識別單元的膠體晶體凝膠非標記可視化檢測方法

無效

• 申請號: 201210007176.0
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102590185A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 顧忠澤;葉寶芬;趙遠錦;謝卓穎;程瑤;上官鳳棲
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N21/75
• 分類號: G01N21/75
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 范晴

技術領域

本發明涉及一種非標記可視化檢測方法，特別涉及一種以適體為識別單元的膠體晶體凝膠薄膜為載體的非標記可視化檢測方法。

背景技術

生物傳感器是簡單、快速、廉價的重要檢測工具。在生物傳感器的分子識別元件中，目前應用最為成熟的就是抗體。但抗體由于制備繁瑣、成本高、耗時長、保存條件苛刻、固定化易失活等缺點使其應用受到限制。探索新型高特異高穩定的分子識別物質，建立高選擇性高靈敏的生物傳感技術成為現代分析化學研究的前沿課題之一。隨著人類基因組計劃的完成及核酸研究的發展，特別是1990年美國科學家Tuerk和Ellington篩選出首個核酸適體，隨后核酸適體及SELEX技術的快速發展，抗體技術受到了前所未有的挑戰。利用體外篩選技術獲得的適體，由于其獨特的優點，成為新一代理想的傳感器識別元件，適體傳感器的研究受到了科學家們的極大關注。

與目前在生物醫學領域中廣泛應用的抗體相比，核酸適體是一種全新的分子識別方法，核酸適體不僅能和抗體一樣與目標分子高效專一結合，還具有許多抗體無法比擬的優點：篩選周期短，成本低、靶分子種類廣泛、高特異性和高親和力、修飾靈活、穩定性好等。正是由于以上種種優勢，適體已成為一種極富應用潛力的識別分子識別探針，可應用于各種小分子、蛋白質、及細胞檢測系統的構建，為生物傳感器的研究提供了一個嶄新的平臺。

膠體晶體是由一種或多種單分散的膠體顆粒(無機或有機，尺度在微米或亞微米級)組裝形成的具有二維或三維有序結構的一類物質，其最基本的特征是光子帶隙。膠體晶體衍射波峰位置遵循布拉格衍射公式，即mλ＝2ndsinθ，其中m為衍射級數，λ為衍射波長，n為膠體晶體的平均折射率，d為膠體晶體的晶格間距，θ為入射光角度。由此可見，衍射光的中心波長(即特征反射峰)與平均折射率和晶格常數有關。響應性膠體晶體是指光子帶隙對外界環境的變化具有響應性的膠體晶體。自1997年Asher等開發了新型的膠體晶體化學智能傳感材料以來，響應不同外界環境的膠體晶體逐漸成為膠體晶體研究領域的一大熱點。膠體晶體傳感器主要是利用膠體晶體能夠產生布拉格衍射的性質，通過外界環境的激勵改變其平均折射率或晶格常數，從而會引起衍射峰的改變。在某些情況下膠體晶體受外界刺激的響應而引起的特征反射峰的變化，可以被人的裸眼直接觀察到，因此膠體晶體作為一種新的可視化傳感材料在生物、化學傳感等方面已嶄露頭角。通過膠體晶體結構的設計，目前已經有許多基于膠體晶體的傳感器被制備出來。

但是目前已開發的膠體晶體傳感器還存在的傳感器功能簡單，分子識別單元抗體易失活，檢測方法單一等缺點，嚴重制約了膠體晶體傳感器的靈敏度、選擇性、重復使用性和快速響應能力等性能指標。

發明內容

為了解決現有非標記可視化檢測選擇性差，成本高等缺點，本發明提供一種以適體為分子識別單元的膠體晶體凝膠非標記可視化檢測方法。

為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案是：

一種以適體為識別單元的膠體晶體凝膠非標記可視化檢測方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

(1)膠體晶體水凝膠薄膜的制備：將單分散的膠體納米粒子加入水凝膠前聚體溶液中，調節膠體納米粒子溶液中膠體納米粒子的質量百分數為10％～80％，超聲分散，直至膠體納米粒子溶液產生結構色；然后加入引發劑后，灌入模具，靜置0.1～2h，經紫外光照射聚合或烘箱內通過熱固化法對結構色膠體溶液進行固化，即得膠體晶體水凝膠薄膜，將所得到的膠體晶體水凝膠薄膜從模具上剝落，洗滌后置于純水中保存；

(2)適體修飾的膠體晶體水凝膠薄膜的制備：

通過化學鍵偶聯方法將適體偶聯在步驟(1)中洗滌后的膠體晶體水凝膠薄膜上，制成適體修飾的膠體晶體水凝膠薄膜，將制備好的薄膜用磷酸緩沖液洗滌之后得到檢測用的膠體晶體水凝膠薄膜，測定檢測用的膠體晶體水凝膠薄膜的反射光譜；

(3)目標分析物的檢測：

將步驟(2)中得到的檢測用的膠體晶體水凝膠薄膜在緩沖溶液中與待測樣品混合進行適體和樣品的特異性結合反應，反應完畢，洗滌后檢測反應后的膠體晶體水凝膠薄膜的反射光譜，通過比較反應前后膠體晶體水凝膠薄膜的顏色或通過測定膠體晶體水凝膠薄膜的反射光譜，確定待測物質的含量。

優選的，所述方法步驟(2)采用的適體為分子識別單元，為核酸適體或RNA適體中的一種或多種。