[發明專利]利用大腸桿菌產γ-谷氨酰轉肽酶高效合成L-茶氨酸的方法

無效

• 申請號: 201210007175.6
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102533887A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 王漢領;徐大春;沈青紅;呂志祥;萬紅貴;殷志敏
• 申請（專利權）人: 江蘇阿格羅生物科技有限公司
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 南京天翼專利代理有限責任公司 32112
• 代理人: 蔣家華

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及利用大腸桿菌產γ-谷氨酰轉肽酶高效合成L-茶氨酸的方法。

背景技術???

?????L-茶氨酸(N-乙基-γ-谷氨酰胺，theanine)是一種天然的氨基酸,是茶葉中的特征氨基酸，也是茶葉中有效的呈味物質。L-茶氨酸主要用于：（1）作為一種新興的食品添加劑，可用作為茶飲料的品質改良劑、改善食品風味的添加劑、功能食品的添加劑、“情緒食品”的添加劑等；已在歐美、日本、中國臺灣等國家、地區廣泛使用。如日本已開發出添加茶氨酸的巧克力、果凍、布丁、口香糖、保健茶和各種清涼飲料。（2）作為醫藥中間體領域，茶氨酸可以用作抗腫瘤、降血壓、安神鎮靜、抗疲勞等藥物中。此外L-茶氨酸現已作為鎮靜劑中的有效成分，對帕金森氏癥、老年性癡呆、傳導神經功能紊亂等疾病起預防效果。

L-茶氨酸的生產方法主要有茶葉提取法、化學合成法、微生物發酵酶轉化法。（1）茶葉提取法由于茶葉中茶氨酸的含量不高，從茶葉提取茶氨酸無法實際生產價值。所以植物提取法實際上是從提取茶多酚后的殘留液中用離子交換樹脂法提取茶氨酸。缺點是生產工序復雜、產品純度低、產量小、價格高。（2）化學合成L-茶氨酸需要高溫、高壓及化學催化劑等條件，反應條件要求比較高，副產物多，且產生的都是DL-型消旋體，?還需要進行拆分才能得到L-型產品。因此，消旋體的拆分是制約茶氨酸的化學合成法的主要因素。由于化學合成方法在解決手性方面有一定難度，因此會使成本提高以及質量難以控制，且易混雜有毒物質，產品不宜用于食品行業應用，同時生產工藝復雜，且易造成環境污染。（3）微生物發酵酶轉化法生產的L-茶氨酸都是L型的，且生產成本低，可大量生產，由于生物酶法合成具有高度的專一性，所以在產品質量方面更接近天然的L-茶氨酸，其發展前景非常廣闊。此外酶轉化法生產L-茶氨酸還具有純度高、副產物少、純化步驟少、生產能力強等優點，因此微生物發酵酶轉化法是目前國內外研究人員公認的最直接、最經濟的L-茶氨酸生產方法。

利用微生物發酵酶轉化法生產L-茶氨酸的酶主要有谷氨酰酶和γ-谷氨酰轉肽酶，本實驗是研究利用大腸桿菌發酵產γ-谷氨酰轉肽酶，專利號為200910035096.4的文件中公開了“高效轉化谷氨酰胺合成L-茶氨酸的大腸桿菌菌株及其應用”，所述的“大腸桿菌”是指大腸桿菌（Escherichia?coli）南師一號CCTCC?No.M209166，該大腸桿菌高產茶氨酸合成酶,高效轉化谷氨酰胺和乙胺為L-茶氨酸；大腸桿菌（Escherichia?coli）南師一號CCTCC?No.M209166的原始發酵液的制備方法參見該文件說明書第4頁中的實施例2，包括如下步驟：（1）將大腸桿菌南師一號接種于LB固體培養基，每升培養基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl?10g，瓊脂15g，37℃培養12h，（2）挑單菌落接種于10ml?LB液體培養基，每升培養基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl?10g，用去離子水定容至1升，37℃震蕩培養12h，（3）然后接種到液體發酵培養基，37℃震蕩培養12h后獲得大腸桿菌（Escherichia?coli）南師一號CCTCC?No.M209166的原始發酵液。

上述發酵液中γ-谷氨酰轉肽酶是在大腸桿菌細胞內產生，60%的γ-谷氨酰轉肽酶分泌到細胞外，40%的γ-谷氨酰轉肽酶仍在細胞內，為了充分利用細胞內的酶，有人在發酵末期離心收集菌體，然后破壁收集酶液，目前國際上報道的主要采用煮沸、凍融、酶解、超聲波等破壁方式，使微生物菌體破碎釋放出酶液；這些破壁方式操作工藝復雜、耗時、耗能、還會引進雜質，更壞的是會降低酶的活性，使L-茶氨酸的轉化率降低；另外一種方法是在反應過程中通過加入過量乙胺，以利于酶反應的進行，然后加入鹽酸回調pH,然而這種回調pH方式會消耗大量鹽酸，大量的鹽酸會對金屬反應器造成很大的腐蝕，同時引進雜質氯離子，這為后期的分離帶來很到的困難。

發明內容

本發明克服了現有技術中的不足，提供一種簡單高效、低耗能、不引進雜質的利用大腸桿菌產γ-谷氨酰轉肽酶高效合成L-茶氨酸的方法。

本發明的技術方案如下：

利用大腸桿菌產γ-谷氨酰轉肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，包括如下步驟：

a)?將大腸桿菌（Escherichia?coli）南師一號CCTCCNo.M209166的原始發酵液利用孔徑為0.001-0.01um的超濾膜進行過濾，得到酶和菌體的截留液；