[發明專利]一種鼠尾膠原蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 201210007089.5
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102586372A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 任海濤;鐘志勇;唐小江;鄺少松;劉科;饒子亮;嚴家榮;鄭佳琳;王剛
• 申請（專利權）人: 廣東省醫學實驗動物中心
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K14/78;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 程躍華

【技術領域】

本發明涉及一種鼠尾膠原蛋白的制備方法。尤其涉及一種鼠尾膠原蛋白適合的工業化生產的制備方法。

【背景技術】

膠原蛋白是一種重要的功能性蛋白質，膠原蛋白含有一種獨有的氨基酸——羥脯氨酸(Hyp)，膠原蛋白與細胞增生、分化、運動、免疫、關節潤滑等密切相關，已被廣泛應用于醫藥、食品、日用化工、生物合成等領域，如醫用膠囊、食用明膠、照相明膠、化妝品等。鼠尾膠原蛋白是膠原蛋白的一種，主要為I型膠原蛋白。I型膠原主要存在于真皮、腱、骨、牙本質。最普遍的以纖維形式形成膠原，由三股纏繞形成多肽鏈組。鼠尾膠原蛋白可用于包被細胞培養器皿，培養一些在普通細胞培養器皿中不易貼壁的細胞；也可以用于制備三維膠，模擬真實的生長環境，使細胞在三維環境中生長。目前，提取鼠尾膠原蛋白的研究并不多，主要采用的還是傳統的方法，比如酸溶法、堿溶法、超聲法、中性鹽法、酶法等等，但是都有其缺點。其中酸溶法、堿溶法、超聲法、中性鹽法不僅存在提取得率低，還可能破壞膠原蛋白的三維立體結構。酶法應用較廣，但是除去酶制劑需要酶抑制劑，且操作復雜，同時增加了后期分離純化鼠尾膠原蛋白的難度。迄今為止，還沒有針對鼠尾膠原蛋白進行過大規模制備的相關研究的報道。

【發明內容】

本發明的目的就是為了克服現有制備鼠尾膠原蛋白方法所存在的提取得率低、分離純化工藝復雜、沒有大規模生產的方法等缺點，提供一種工藝簡單、提取率高、提取的產品純度高的鼠尾膠原蛋白的制備方法。

本發明的制備方法包括如下步驟：

1、緩沖溶液的準備和配置：0.1-5mol/L?NaCl溶液、0.01-0.2mol/L?Tris-HCl緩沖鹽溶液、0.05-2mol/L醋酸溶液。

2、從鼠尾中分離出鼠尾腱。抽提出的鼠尾腱放置與0-10℃下的0.01-0.2mol/L?Tris-HCl緩沖鹽溶液，所抽提的尾腱呈銀白色的絲狀。

3、0-10℃下預處理4-36小時，期間定時攪拌，除去中性條件下可溶解的糖蛋白和其他雜蛋白。將處理過后的尾腱濾干水分，稱重。以每克鼠尾腱配置50mL、置于0-10℃下的0.05-2mol/L醋酸溶液。

4、以1∶1000-1∶50000的配比分配加入胃蛋白酶，共分三次加入，12-36小時加完。期間不間斷攪拌至所有尾腱均被酶解呈現乳膠狀。酶解持續36-144小時。

5、將乳膠狀溶液于0-10℃條件下離心10-40分鐘，除去不呈現乳膠狀的固化物。往乳膠溶液中以1∶0.5-1∶2的體積配比加入0.01-0.1mol/L醋酸溶液。攪拌至膠狀溶液成分混勻。

6、加入0.1-5mol/L?NaCl溶液至乳膠狀溶液并不斷攪拌至有白色絮狀沉淀在溶液中不再析出為止。高速離心溶液20-50min。收集沉淀。將乳膠溶液以1∶0.5-1∶4的體積比的量加入0.1-5mol/L?NaCl溶液，于0-10℃下放置6-48h。次日重復步驟6。

7、集中步驟6中收集到的沉淀。用0.01-2mol/L醋酸溶液重復溶解后加入0.1-5mol/L?NaCl溶液再次析出膠原蛋白。高速離心溶液20-50min。收集沉淀。重復此步驟1-5次直至所沉淀的膠原蛋白能夠完全溶解。

8、將純化完全的膠原蛋白用0.01-2mol/L醋酸溶液充分溶解。灌注于萬級分子量截留的透析袋中透析48-96h。每天換水2-8次。透析外液用雙蒸水進行。

9、將透析完全的膠原蛋白溶液分裝入20mL每瓶的小型玻璃瓶，-40℃-0℃條件下進行冷凍干燥48-144h。凍干產品即為鼠尾膠原蛋白凍干粉。

依照本發明專利使用的酸聯合酶法提取工藝，每只鼠尾大約可以提取膠原蛋白200mg，與傳統的酸溶法、堿溶法及中性鹽法相比較(10mg)，提取率有了大幅度的提高。

本發明的鼠尾來自于成年各品系大鼠鼠尾(如ACI、BVF、F344、PA、M520、WAB、WAC、WKA、SD、RF、Wistar等品系)、各品系小鼠鼠尾等(C3H、CBA/N、C57BL/6、C57BL/10、C57L、DBA/2、A、AKR、BALB/c、RF、SWR等品系)。

為了保證制備的鼠尾膠原蛋白的質量，本發明涉及的鼠尾膠原蛋白的提取也可以來自于SPF級(無特定病原體)成年SD大鼠鼠尾。

前述步驟4中胃蛋白酶三次加入的時間和量分別是首次加入三分之一，后1-12小時后加入三分之一，12-36小時后加入剩余三分之一。

前述步驟4中胃蛋白酶的配比為1∶10000，酶解持續72小時。