[發(fā)明專利]一種鼠尾膠原蛋白的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210007089.5
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102586372A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 任海濤;鐘志勇;唐小江;鄺少松;劉科;饒子亮;嚴(yán)家榮;鄭佳琳;王剛
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K14/78;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 程躍華

1.一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，包括如下步驟：

1)、緩沖溶液的準(zhǔn)備和配置：0.1-5mol/L?NaCl溶液、0.01-0.2mol/LTris-HCl緩沖鹽溶液、0.05-2mol/L醋酸溶液；

2)、從鼠尾中分離出鼠尾腱。抽提出的鼠尾腱放置與0-10℃下的0.01-0.2mol/L?Tris-HCl緩沖鹽溶液，所抽提的尾腱呈銀白色的絲狀；

3)、0-10℃下預(yù)處理4-36小時，期間定時攪拌，除去中性條件下可溶解的糖蛋白和其他雜蛋白；將處理過后的尾腱濾干水分，稱重；以每克鼠尾腱配置50mL、置于0-10℃下的0.05-2mol/L醋酸溶液；

4)、以1∶1000-1∶50000的配比分配加入胃蛋白酶，共分三次加入，12-36小時加完。期間不間斷攪拌至所有尾腱均被酶解呈現(xiàn)乳膠狀；酶解持續(xù)36-144小時；

5)、將乳膠狀溶液于0-10℃條件下離心10-40分鐘，除去不呈現(xiàn)乳膠狀的固化物；往乳膠溶液中以1∶0.5-1∶2的體積配比加入0.01-0.1mol/L醋酸溶液；攪拌至膠狀溶液成分混勻；

6)、加入0.1-5mol/L?NaCl溶液至乳膠狀溶液并不斷攪拌至有白色絮狀沉淀在溶液中不再析出為止；高速離心溶液20-50min；收集沉淀；將乳膠溶液以1∶0.5-1∶4的體積比的量加入0.1-5mol/L?NaCl溶液，于0-10℃下放置6-48h；次日重復(fù)步驟6；

7)、集中步驟6中收集到的沉淀，用0.01-2mol/L醋酸溶液重復(fù)溶解后加入0.1-5mol/L?NaCl溶液再次析出膠原蛋白；高速離心溶液20-50min；收集沉淀；重復(fù)此步驟1-5次直至所沉淀的膠原蛋白能夠完全溶解；

8)、將純化完全的膠原蛋白用0.01-2mol/L醋酸溶液充分溶解；灌注于萬級分子量截留的透析袋中透析48-96h；每天換水2-8次；透析外液用雙蒸水進(jìn)行；

9)、將透析完全的膠原蛋白溶液分裝入20mL每瓶的小型玻璃瓶，-40℃-0℃條件下進(jìn)行冷凍干燥48-144h，凍干產(chǎn)品即為鼠尾膠原蛋白凍干粉。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，其特征在于鼠尾來自于成年各品系大鼠鼠尾或各品系小鼠鼠尾。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，其特征在于步驟4中胃蛋白酶三次加入的時間和量分別是首次加入三分之一，后1-12小時后加入三分之一，12-36小時后加入剩余三分之一。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，其特征在于步驟4中胃蛋白酶的配比為1∶10000，酶解持續(xù)72小時。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，其特征在于步驟5中離心轉(zhuǎn)速為1000-10000rpm/min，步驟6中高速離心轉(zhuǎn)速為4000-12000rpm/min，步驟7中高速離心轉(zhuǎn)速4000-12000rpm/min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，其特征在于步驟8中，透析時，采用搖床低速轉(zhuǎn)動，采用硝酸銀溶液檢驗透析外液無沉淀，表明透析完成。

7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，其特征在于鼠尾來自于SPF級成年SD大鼠鼠尾。