[發(fā)明專利]黏附特異性多肽序列聚己內(nèi)酯多元醇-磷酸三鈣支架

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210007080.4
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102552980A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設計）人: 彭浩;周葉方;吳獻青
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學湘雅三醫(yī)院
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/34
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 胡山

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種組織工程生物支架，尤其是黏附特異性多肽序列聚己內(nèi)酯多元醇-磷酸三鈣支架。

背景技術(shù)

成體干細胞具有較強組織再生修復功能，但量少且細胞活性隨體外擴增次數(shù)增多而下降，限制了干細胞在臨床上的應用。培養(yǎng)可用于臨床的干細胞于三維類細胞外基質(zhì)環(huán)境中可延緩干細胞衰老。

發(fā)現(xiàn)可延緩干細胞衰老，維持干細胞分化潛能的新型生物支架及其培養(yǎng)體系，對干細胞體外擴增及組織工程臨床應用有重要意義。以三維聚己內(nèi)酯多元醇-磷酸三鈣(polycaprolactone-tricalcium?phosphate?PCL-TCP)生長支架為基礎，結(jié)合不同特定細胞粘附膠原多肽（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸?Arg—Gly—Asp?RGD序列、天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸?Asp—Gly—GIu—Ala?DGEA?序列）制備三維類細胞外基質(zhì)環(huán)境新型組織工程生物支架，國內(nèi)外尚無類似研究報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供黏附特異性多肽序列聚己內(nèi)酯多元醇-磷酸三鈣支架，以解決上述背景技術(shù)中的缺點。

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

本發(fā)明結(jié)合不同特定細胞粘附膠原多肽序列（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸?Arg—Gly—Asp?RGD序列、天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸?Asp—Gly—GIu—Ala?DGEA?序列）修飾PCL－TCP支架，將多肽分子以交聯(lián)方式固定于支架表面，交聯(lián)比例為比例為?0.2毫克多肽/每平方毫米表面積支架。

黏附特異性多肽序列支架制備方法，包括以下步驟：

第一步：PCL－TCP活化：PCL－TCP支架用10%?(w/w)?1,6-hexanediamine/?isopropanol?(DEA/IPA己二胺/異丙醇)溶液處理，常溫25℃，時間30分鐘到90分鐘，完成后用0.3%Tween?20（吐溫20）和去離子水充分洗滌，干燥；

第二步：0.1M多肽（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸?Arg—Gly—Asp?RGD序列及天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸?Asp—Gly—GIu—Ala?DGEA?序列）,?EDC?（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽）,?N-hydroxysuccinimide?(NHS,N-羥基琥珀酰亞胺)分別配制于2-(N-morpholino)-ethanesulfonic?acid?(MES，2-(N-嗎啉)乙磺酸)?緩沖液?(pH=5.5)中；

第三步：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg—Gly—Asp?RGD）序列及天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸?（Asp—Gly—GIu—Ala?DGEA）?序列溶液首先和EDC?溶液以?1:1?摩爾比混合；

第四步：相當于25%EDC摩爾量的NHS?加入到混合液，使得最終溶液中多肽：EDC：NHS摩爾比=4:4:1；

第五步：溶液配好立即處理支架，將已活化的PCL－TCP支架置入多肽：EDC：NHS混合溶液中，比例為?0.2毫克多肽/每平方毫米表面積支架。常溫下處理時間3小時左右；

第六步：完成后用磷酸緩沖液沖洗，干燥即形成支架。

有益效果

本發(fā)明制成的組織工程支架，對于多次傳代（10，20，30）骨髓間充質(zhì)干細胞及其他來源的干細胞如來源于脂肪組織的干細胞，培養(yǎng)后的形態(tài)觀察，老化細胞量及增殖速度測定、細胞增殖計數(shù)?、³H標胸腺嘧啶攝取率測定、CFU克隆增殖試驗、β-半乳糖苷酶試劑盒試劑盒測定衰老程度測定、增殖衰老相關蛋白質(zhì)(PPARr,?stro-1,?P53,?C-myc,?Bcl-2,?TERT)表達變化情況、檢測不同傳代細胞表面抗原及凋亡細胞量，證實:?本發(fā)明制成的組織工程支架能夠延緩干細胞衰老，維持間充質(zhì)干細胞及其他類型的干細胞的分化潛能。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的實施工藝流程圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體圖示，進一步闡述本發(fā)明。