[發明專利]一種新型的無動物源、無飼養層的人多能干細胞培養系統

有效

• 申請號: 201210007010.9
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102586176A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 馬躍;王奇慧;牟曉寧
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/0735
• 代理公司: 北京市中聞律師事務所 11388
• 代理人: 楊改鳳

技術領域

本發明細胞培養技術領域，特別涉及一種新型的無動物源、無飼養層的人多能干細胞培養系統，適用于人多能干細胞的長時間培養。

背景技術

人多能干細胞典型特點是，在體外不斷自我更新，同時保持向各個胚層細胞分化的潛能。由于人胚胎干細胞建立涉及倫理與法律等問題，其研究與應用受到一定的限制。而誘導多能干細胞很好地解決了人胚胎干細胞存在的倫理爭議，同時由于其具有與人胚胎干細胞相似的特性，即自我更新與分化潛能，因而為再生醫學尤其是個性化的治療帶來了希望。

人多能干細胞不僅為基礎研究提供了獨特的模型，而且在細胞移植治療方面具有巨大的應用價值。然而在培養人多能干細胞時，其與動物源制品(如動物血清或動物蛋白)的接觸會提高這種細胞吸收非人源代謝產物或被非人源病原污染的風險。例如，在有動物源成分存在的培養體系中，細胞會吸收并表達唾液酸Neu5Gc。由于人類循環系統中存在識別Neu5Gc的抗體，當含有Neu5Gc的細胞或組織移植入人體時，機體會識別這些非人源的抗原，從而對移植細胞或組織產生排斥反應，造成移植失敗。同時飼養層的存在導致耗費大量的人力和物力，且飼養層細胞的批次性也會導致系統的不穩定性。因此，確定培養系統中的各種成分則有利于優化培養系統并具有較高的可重復性。

近年，研究者們研究發展出如下不同的人多能干細胞的培養系統：

(一)飼養層培養體系的發展

人多能干細胞最初在以小鼠的胚胎干細胞的培養系統衍化而來的條件下建立并進行培養的，即含有鼠胚胎成纖維細胞的飼養層以及含有胎牛血清的培養基。為降低培養系統中非人源成分，研究者嘗試不同組織來源的人源細胞作為飼養層培養人多能干細胞。Richard(Richards，M.，Fong，C.Y.，Chan，W.K.，Wong，P.C.&Bongso，A.、Human?feeders?support?prolonged?undifferentiated?growth?of?human?inner?cell?masses?and?embryonic?stem?cells、Nat?Biotechnol、2002、20、9、933-6。)等首次以胎兒/成人成纖維細胞作為飼養層，以人血清作為培養基，建立首個無動物源的培養系統。隨后人骨髓來源間充質細胞，新生兒包皮細胞，人胚胎干細胞分化來源的成纖維樣細胞，胎盤來源的間充質干細胞等被嘗試用作人多能干細胞的飼養層。雖然各種人源細胞用于培養人多能干細胞，但是其支持人多能干細胞不分化的能力各不相同。這可能與細胞來源，培養條件的不同等因素有關。同時，制備飼養層的細胞也需要大量的人力、物力，其批次之間的差異性也無法解決。因此，發展無飼養層的培養系統具有更大的應用價值。

(二)無飼養層培養體系的發展

Xu(Xu，C.，et?al.、Feeder-free?growth?of?undifferentiated?human?embryonic?stem?cells、Nat?Biotechnol、2001、19、10、971-4。)等首次報道將人多能干細胞培養在由Matrigel(BD公司)作為細胞外基質以及鼠胚胎成纖維細胞來源的條件培養基構成的無飼養層的培養系統內。兩種培養系統內人胚胎干細胞的mRNA表達譜相似，說明在此無飼養層的培養系統內，細胞不會受到額外的刺激。Matrigel是鼠EHS瘤細胞的提取物，因其來源提高人多能干細胞臨床應用的風險以及其成分的不確定性，因此研究者們嘗試以純化的蛋白或人工合成物替代Matrigel。在胚胎成纖維細胞來源的條件培養基作為培養基以及含牛血白蛋白的無血清培養基中，層黏連蛋白(Laminin)、纖維連接蛋白(Fibronectin)和重組表達的玻璃粘連蛋白(Vitronectin)均被報道能夠代替Matrigel長期維持人多能干細胞的增殖。2006年，Ludwig(Ludwig，T.E.，et?al.、Derivation?of?human?embryonic?stem?cells?in?defined?conditions、Nat?Biotechnol、2006、24、2、185-7。)等報道在成分明確的培養基TeSR中使用四種大分子的混合物包括層黏連蛋白、纖維連接蛋白、玻璃粘連蛋白和膠原IV(Colagen?IV)等成功培養人多能干細胞并在此培養系統中建立新的人多能干細胞細胞株。但由于此培養系統的高昂費用不便于推廣應用。

(三)培養基的發展