[發明專利]一種新型的無動物源、無飼養層的人多能干細胞培養系統

有效

• 申請號: 201210007010.9
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102586176A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 馬躍;王奇慧;牟曉寧
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/0735
• 代理公司: 北京市中聞律師事務所 11388
• 代理人: 楊改鳳

1.一種新型的無動物源、無飼養層的人多能干細胞培養系統，其特征在于：包括支持人多能干細胞長期培養的人源化基質和人源化培養基，所述的人源化基質富含人IV型膠原、纖維粘連蛋白和層粘連蛋白，所述的人源化培養基富含纖維粘連蛋白和玻璃連接蛋白。

2.根據權利要求1所述的人多能干細胞培養系統，其特征在于：所述的人源化基質按如下步驟制備而成：

(1)新鮮胎盤去掉羊膜與臍帶后，剪成不超過0.3×0.3×0.3cm大小的組織塊，以冷水將組織塊懸起，4℃攪拌，12h后，用1mm×1mm的篩網過濾，將截留的組織仍用冷水懸起，以冷水洗2天，每12h換水一次，第三次過濾后，將截留的組織用冷的1M?NaCl緩沖液懸起，4℃攪拌；其中所述的NaCl緩沖液按如下方法配制：58.5g?NaCl與25ml?Tris緩沖液，溶于Milli-Q水中，調節pH至7.5，定容至1L；所述的Tris緩沖液按如下方法配制：242.28g?Tris堿溶于800ml?Milli-Q水中，調節pH至7.5，加Milli-Q水定容至1L；

(2)以冷的1M?NaCl緩沖液洗4天，每12h換液一次，第八次更換NaCl緩沖液時，用1mm×1mm的篩網過濾，將截留的組織用冷的0.5M醋酸溶液懸起，4℃攪拌；

(3)以冷的0.5M醋酸溶液洗3天，每12h換液一次，第六次換0.5M醋酸溶液時，用1mm×1mm的篩網過濾，將截留的組織稱重；以胃蛋白酶∶組織為1∶400的質量比加入胃蛋白酶，同時以200g/L將酶與組織塊懸起于0.5M醋酸溶液中，4℃攪拌24h；

(4)7100g，4℃離心1h，去掉上清，收集沉淀并稱重，以質量體積比為1∶1的條件加入2M尿素緩沖液，4℃攪拌24h；其中所述的尿素緩沖液按如下方法配制：240.0g尿素、12.1g?Tris堿、18.0g?NaCl溶于1.8L?Milli-Q水中，濃HCl調節pH至7.4，Milli-Q水定容至2L；

(5)13000rpm，4℃離心30min，上清液裝入25KD的透析袋中，以TBS緩沖液+0.5％氯仿為周圍溶液于4℃透析2h，然后徹底清洗燒杯與透析袋外表面后，以冷的TBS緩沖液為周圍溶液，繼續4℃透析，每2h換TBS緩沖液一次，共換3次，最后一次透析時，4℃，過夜，透析好的液體，即為人源化基質；其中所述的TBS緩沖液按如下方法配制：12.1g?Tris堿，18.0g?NaCl溶于1.8L?Milli-Q水中，濃HCl調節pH至7.4，Milli-Q水補齊至2L。

3.根據權利要求1所述的人多能干細胞培養系統，其特征在于：所述的人源化培養基含有人血漿的NaCl沉淀組分。

4.根據權利要求3所述的人多能干細胞培養系統，其特征在于：所述的人血漿的NaCl沉淀組分按如下步驟制備而成：

(1)將經過安全檢測的四種血型的血漿，以等體積比例混合，分裝成36ml/BD管，每管加入6ml的林格液，混合均勻后再加入2M?CaCl₂至終濃度為20mM，混勻，置于37℃水浴鍋孵育兩小時，將已凝固的血漿，存于-20℃過夜；

(2)將處理過的血漿從-20℃冰箱拿出置于4℃冰箱，過夜解凍，高速冷凍離心機在4℃，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，即是血漿來源的血清；

(3)在4℃冷柜中，向血清中緩慢、均勻地加入NaCl，至終濃度為28g/100ml，攪拌過夜；

(4)高速冷凍離心機在4℃，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，將收集的上清用濾紙過濾掉懸浮的小顆粒；

(5)將過濾的上清，裝入25KD的透析袋中，在冷的雙蒸水中攪拌透析2小時以上；

(6)重復步驟(5)兩次；

(7)將步驟6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12培養基，攪拌透析過夜；

(8)取出透析袋內的溶液，以外部DMEM/F12培養基為對照，280nm測定蛋白濃度，0.22μm過濾后，保存于4℃，此即為血漿的NaCl沉淀組分。

5.根據權利要求4所述的人多能干細胞培養系統，其特征在于：步驟(1)中所述的林格液按如下方法配制：將NaCl?0.9g，KCl?0.042g，CaCl2?0.0242g，溶于100ml的雙蒸水，用0.22um的濾膜過濾備用。