[發明專利]一種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法

有效

• 申請號: 201210006985.X
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102559747A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 張艷敏;張孟臣;張紅梅;蔣春志;郭秀林;劉子會
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院遺傳生理研究所;河北省農林科學院糧油作物研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 石家莊匯科專利商標事務所 13115
• 代理人: 王琪;張梅申

技術領域

本發明涉及植物基因工程領域，涉及一種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，更具體的說是一種通過抑制大豆異黃酮生物合成途徑的關鍵酶-苯丙氨酸解氨酶PAL的活性，克服大豆遺傳轉化障礙、提高其農桿菌轉化效率的方法。

背景技術

作物遺傳轉化常用的方法是基因槍法和農桿菌法。基因槍法由于穿透力強，包被在微彈中的外源基因借助轟擊壓力直接穿過細胞壁和細胞膜而進入植物基因組，從而實現外源基因轉化的目的，因此基因槍法具有轉化時間短、無宿主限制等優點。但適宜基因槍法的受體大多需要經過愈傷誘導、綠苗分化再生等繁瑣的組織培養過程，而大豆的愈傷誘導、綠苗分化再生較難，因此目前很少用基因槍法轉化大豆。農桿菌法是利用根癌農桿菌對植物的侵染特性把外源基因導入植物基因組的方法，因其拷貝數少、整合完整、遺傳穩定以及受目的基因分子量限制小而廣泛應用于植物的遺傳轉化。雙子葉植物雖然是農桿菌的天然宿主，但直到1983年才由Pederson等證明了大豆可作為農桿菌的合適宿主。Hinchee等(1988)首次報告了農桿菌成功轉化大豆的事例。自Hinchee等(1988)首次報道利用農桿菌轉化大豆子葉節成功以來，因其不必經過愈傷組織的誘導過程，直接從子葉節部位的分生組織分化出芽，解決了大豆的離體再生難問題，使得農桿菌轉化子葉節法成為最常用的大豆遺傳轉化方法。目前對農桿菌轉化大豆的研究主要集中在選用強毒力菌株、構建高效表達載體、添加化學物質誘導VIR基因的高效表達、以及防止組織壞死提高T-DNA轉移效率等方面，這些都是通過研究農桿菌轉化大豆的外源物質或農桿菌本身等大豆外部因素來實現大豆遺傳轉化的，轉化率低，而對于通過調節大豆內源物質降低對農桿菌侵染的抑制作用方面的研究未見報道。

大豆富含異黃酮，大豆異黃酮可調節復雜的植物/微生物互作(馬君蘭等，2007)，在動物上具有提高機體免疫力的功效。異黃酮類物質是由苯丙烷類代謝途徑的一個分支所合成的，而苯丙氨酸解氨酶PAL是其生物合成途徑的第一個關鍵酶，能夠在轉錄和轉錄后水平對異黃酮的生物合成進行調控。有研究表明，苯丙氨酸解氨酶PAL抑制劑處理甘薯后幾個小時內就可以檢測到PAL酶活性的降低及下游代謝產物合成積累的受阻(王敬文等，1981)，而農桿菌一般在附著外植體16個小時后才開始T-DNA的轉移(王關林等，1998)，這就為農桿菌轉化大豆過程中人為調控PAL酶活性提供可能性和時機。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述技術缺陷提供一種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法。本發明的原理是通過苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，抑制大豆異黃酮合成的關鍵酶PAL，減少大豆異黃酮類次生代謝產物的合成和積累，從而降低大豆外植體的“免疫力”，提高農桿菌的被侵染力，也就是說從改善植物/農桿菌互作關系方面提供了一種提高大豆遺傳轉化效率的方法。

本發明提供了一種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于包括如下步驟：

①種子的消毒：取健康飽滿大豆種子，放入含有100ml?30％次氯酸鈉和4ml濃鹽酸的密閉容器內，利用反應生成的氯氣消毒24～36小時；

②種子的萌發培養：將步驟①中的種子接種到B₅萌苗培養基中進行為期5～6天的25℃、16/8h光暗周期的培養；

③外植體制備：將步驟②中的種子在無菌條件下去掉種皮、切掉幼葉和上胚軸，保留0.5～2.0cm的下胚軸，用手術刀片對子葉節部位進行創傷處理；

④固體共培養基的制備：向經過121℃高壓滅菌15min后的含有B₅大量元素、B₅微量元素、6-BA、IBA、MES、蔗糖、瓊脂，PH?5.4的培養基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉，DTT，半胱氨酸，B₅有機成分、乙酰丁香酮AS及苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到φ90mm的滅菌培養皿中；

⑤農桿菌侵染液的制備：將含有外源基因的重組農桿菌懸于含有1/10×B₅大量元素、1/10×B₅微量元素、1×B₅有機成分6-BA1.0mgL^-1、IBA?0.2mg?L^-1、MES?3.9g?L^-1、蔗糖30g?L^-1，乙酰丁香酮AS200μM，PH?5.4的培養基中，調節菌液濃度到OD₆₀₀≈0.5，室溫靜置半小時備用；