[發(fā)明專利]一種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210006985.X
• 申請(qǐng)日: 2012-01-11
• 公開（公告）號(hào): CN102559747A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張艷敏;張孟臣;張紅梅;蔣春志;郭秀林;劉子會(huì)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所;河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 石家莊匯科專利商標(biāo)事務(wù)所 13115
• 代理人: 王琪;張梅申

1.一種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于包括如下步驟：

①種子的消毒：取健康飽滿大豆種子，放入含有100ml?30％次氯酸鈉和4ml濃鹽酸的密閉容器內(nèi)，利用反應(yīng)生成的氯氣消毒24～36小時(shí)；

②種子的萌發(fā)培養(yǎng)：將步驟①中的種子接種到B₅萌苗培養(yǎng)基中進(jìn)行為期5～6天的25℃、16/8h光暗周期的培養(yǎng)；

③外植體制備：將步驟②中的種子在無菌條件下去掉種皮、切掉幼葉和上胚軸，保留0.5～2.0cm的下胚軸，用手術(shù)刀片對(duì)子葉節(jié)部位進(jìn)行創(chuàng)傷處理；

④固體共培養(yǎng)基的制備：向經(jīng)過121℃高壓滅菌15min后的含有B₅大量元素、B₅微量元素、6-BA、IBA、MES、蔗糖、瓊脂，PH?5.4的培養(yǎng)基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉，DTT，半胱氨酸，B₅有機(jī)成分、乙酰丁香酮AS及苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到φ90mm的滅菌培養(yǎng)皿中；

⑤農(nóng)桿菌侵染液的制備：將含有外源基因的重組農(nóng)桿菌懸于含有1/10×B₅大量元素、1/10×B₅微量元素、1×B₅有機(jī)成分6-BA1.0mgL^-1、IBA?0.2mg?L^-1、MES?3.9g?L^-1、蔗糖30g?L^-1，乙酰丁香酮AS?200μM，PH?5.4的培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)菌液濃度到OD₆₀₀≈0.5，室溫靜置半小時(shí)備用；

⑥農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)：將步驟③中的外植體放入100ml三角瓶中，加入步驟⑤制備的農(nóng)桿菌侵染液中，搖床上80rpm低速轉(zhuǎn)動(dòng)30分鐘后，取出外植體，用滅菌濾紙吸掉多余菌液，擺放到步驟④中固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3～5天；

⑦芽誘導(dǎo)和抗性植株的獲得：將步驟⑥中的外植體轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)移到帶有篩選壓的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)14～21天，然后將誘導(dǎo)出抗性芽的外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行芽伸長(zhǎng)，芽長(zhǎng)4～5cm時(shí)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，獲得轉(zhuǎn)化再生植株移栽到花盆中獲得轉(zhuǎn)化的抗性植株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1一種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于步驟④固體共培養(yǎng)基的制備中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑為α-氨氧基乙酸AOA、放線菌素D、激酶抑制劑K252a其中的一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求2一種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于驟④中所述固體共培養(yǎng)基的制備為向經(jīng)過121℃高壓滅菌15min后的含有1/10×B₅大量元素、1/10×B₅微量元素、6-BA1.0mg?L^-1、IBA?0.2mg?L^-1、MES?3.9g?L^-1、蔗糖30g?L^-1、瓊脂5g?L^-1，PH?5.4的培養(yǎng)基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mg?L^-1，DTT?154mg?L^-1，半胱氨酸1g?L^-1，1×B₅有機(jī)成分，AS?200μM及20～50μmol?L^-1α-氨氧基乙酸AOA苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到φ90mm的滅菌培養(yǎng)皿中。