[發明專利]利用幼穗拯救獲得轉基因小麥的方法

有效

• 申請號: 201210006728.6
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN103205455A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 李根英;夏先春;李玉蓮;高潔;宋國琦;宋華東;何中虎;黃承彥;樊慶琦;隋新霞;楚秀生
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院作物研究所;中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種利用幼穗拯救獲得轉基因小麥的方法。

背景技術

轉基因技術是利用異源基因進行種質資源創新的良好途徑，但轉化效率低下是限制轉基因技術在小麥上應用的世界性難題。迄今為止，已報道的小麥轉基因方法主要有花粉管法、基因槍法和農桿菌介導法。其中，花粉管法是利用小麥花粉萌發形成的花粉管通道，將外源基因導入受體。該項技術不需要愈傷組織的培養過程，相比于基因槍法既簡單又經濟，但因其重復性差，很難獲得分子證據，在小麥上的應用越來越少。基因槍法是以金粉或鎢粉作為載體，通過高壓轟擊受體組織將外源基因導入到受體細胞中，并實現基因整合。但基因槍法除了需要消耗昂貴的大載體、可裂膜、阻擋網等一次性耗材外，插入到受體細胞中的基因往往是隨機整合，并且是多拷貝插入。因為小麥是異源六倍體，基因組非常龐大，多拷貝插入除了影響基因的表達效率外，轉基因后代純合較慢，難以迅速獲得純合株系。另外，篩選標記難以去除也是限制基因槍轉化小麥的主要因素之一。農桿菌法則克服了上述兩種方法的缺點，其原理是先用目標基因替換根癌農桿菌上的致癌基因，在農桿菌侵染受體材料時，目標基因被釋放整合進入受體細胞，這種插入往往以單拷貝或低拷貝的形式發生，而且作為質粒復制所需要的篩選標記被留在受體細胞外，提高了轉基因的安全性。

農桿菌介導法的上述優點，賦予它具有極大的應用潛力。但是農桿菌的天然寄主是雙子葉植物，對許多單子葉植物侵染困難。近年來，通過科學家的不斷努力，水稻、玉米、小麥等重要的單子葉植物的轉化相繼成功。就水稻而言，以明恢63成熟胚愈傷組織為受體的農桿菌轉化，其效率已經達到90％。而農桿菌轉化小麥效率低下仍然是一世界性難題。目前，通過農桿菌介導進行轉化的方法主要有兩種：一是農桿菌侵染幼胚、成熟胚及其誘導形成的愈傷組織，通過后續的愈傷誘導、篩選和再生獲得轉基因小麥，但農桿菌侵染后的愈傷組織，往往因為農桿菌的毒性而褐變，無法繼續生長，造成轉化效率低下。二是莖尖分生組織侵染法，即利用農桿菌侵染創傷的莖尖分生組織，不經過愈傷組織的篩選過程，直接收獲種子，然后對獲得的后代進行篩選和鑒定。在這個轉化過程中，因為莖尖是一個高度分化的器官，其中只有部分細胞被轉化，因此，轉化體為轉化細胞與非轉化細胞共存的嵌合體，而且轉化細胞最終發育成為可遺傳器官的幾率微乎其微。因此，單純的莖尖轉化法在轉化當代(T₀代)檢測的陽性比率高達75％，但是在T₁代中的比率極少。

發明內容

本發明的目的是提供一種培育轉基因小麥的方法，包括通過農桿菌介導將目的DNA轉入小麥細胞的步驟，所述方法包括如下步驟：

1)將含有目的DNA表達載體的重組農桿菌接種于胚芽鞘長為1.0mm-1.2mm的露白小麥種子的莖尖分生組織中，培養所述露白小麥種子獲得處于雌雄蕊分化期的幼穗；

2)取步驟1)得到的處于雌雄蕊分化期的幼穗進行離體脫分化得到愈傷組織，保留含有所述目的DNA的愈傷組織，得到所述轉基因小麥。

在上述方法中，步驟1)中所述接種是在所述胚芽鞘長為1.0mm-1.2mm的露白小麥種子的莖尖分生組織中注入1μL所述含有目的DNA表達載體的重組農桿菌菌液。

在上述方法中，所述重組農桿菌菌液的OD₆₀₀為0.6。

在上述方法中，所述重組農桿菌菌液中含有乙酰丁香酮0.4mmol/L。

在上述方法中，所述農桿菌可為根癌農桿菌，具體可為根癌農桿菌EHA105。

在上述方法中，步驟2)中所述離體脫分化按照包括如下步驟的方法進行：將所述處于雌雄蕊分化期的幼穗接種于脫分化培養基中培養，獲得愈傷組織。

在上述方法中，步驟2)中所述離體脫分化得到愈傷組織，保留含有所述目的DNA的愈傷組織后，還包括將所述含有所述目的DNA的愈傷組織接種于分化培養基中培養，獲得具有根莖葉的小麥植株的步驟。

在上述方法中，所述脫分化培養基和所述分化培養基的基礎培養基為MS培養基。

在上述方法中，所述脫分化培養基中含2.5mg/L?2，4-D和/或150mg/L特美汀和/或篩選轉化體的抗生素，pH值為5.8；所述分化培養基中含2mg/L?KT和/或篩選轉化體的抗生素，pH值為5.8。

在上述方法中，所述分化培養基中培養的光照條件為：連續光照，所述連續光照的光照強度為1500LUX。