[發明專利]一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA方法

無效

• 申請號: 201210006075.1
• 申請日: 2012-01-06
• 公開（公告）號: CN102559896A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 黃求應;李剛華;雷朝亮
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 朱盛華

技術領域

本發明屬于分子標記技術領域，具體涉及一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA方法。

背景技術

微衛星DNA又稱簡單序列重復(simple?sequence?repeat，SSR)，其具有高水平的雜合性和突變率、雙親遺傳模式等優勢，已經被廣泛用于基因定位、種質資源鑒定、親緣關系分析、遺傳圖譜構建、品種鑒定以及進化分析等研究(見“Chromosoma”，2000，109：365-371)。

白蟻是最古老的社會性昆蟲，嚴重危害房屋建筑、水庫堤壩和農林植物。由于白蟻生活隱蔽，巢體結構復雜，生殖模式多樣，人們很難直接觀察到白蟻習性，因此白蟻防治工作帶有很大的盲目性。我國學者在上世紀50年代開始采用傳統方法研究白蟻巢群的建立和發展、補充型生殖蟻的產生及其群體發展等，取得了一些重要進展(見《中華衛生殺蟲藥械》，2003，9：8-12)。但是，由于白蟻的筑巢和覓食具有隱蔽性，其在自然環境中的許多重要生物學特性仍然沒有掌握：如白蟻巢群中生殖蟻類型、數量和親緣關系如何？一定區域內原始蟻王蟻后控制的巢群和補充型生殖蟻控制的巢群的比例是多少？

發明內容

本發明的目的是針對上述現狀，旨在提供一種操作簡便，結果可靠，可準確判斷白蟻巢群生殖模式的鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA方法。

本發明目的的實現方式為，一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA方法，具體步驟如下：

1)在野外采集同一巢群，20頭以上的白蟻樣品，將樣品放入裝有95％酒精的樣品管中，置于-20℃冰箱中備用，采樣過程中，測定每個采樣點的經度、緯度和海拔高度；

2)提取白蟻樣品的基因組DNA，再用ND-2000微量紫外/可見分光光度計測定樣品DNA濃度，并統一稀釋成10-20ng/μl待用；

3)在GenBank上查找與白蟻生殖模式相關的微衛星位點；

4)利用軟件Primer?Premier?5.0在微衛星重復序列的側翼設計引物，選用微衛星位點Rf24-2、Rf21-1、Rf6-1、Rs10和RS68的微衛星引物對白蟻樣品DNA進行PCR擴增，PCR擴增反應在PTC-200PCR儀上進行；用6.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產物進行分離，選用分子標準為50-350bp?IRDye800^TM?standard，電泳在LI-COR4300DNA自動分析儀上進行，再使用SAGA^GT軟件測定電泳圖中每個條帶對應樣品的基因型；

5)基于“孟德爾定律”對白蟻樣品的觀測基因型頻率與期望基因型頻率進行卡方檢驗，再判定該白蟻巢群的生殖模式：

①簡單巢群的基因型頻率觀測值與“孟德爾”簡單巢群的基因型頻率預期值沒有顯著差異時為“簡單巢群”，

②擴大巢群的觀測基因型種類數與“孟德爾”簡單巢群的預期基因型種類數不一致，或者經X2檢驗后工蟻的基因型頻率觀測值與“孟德爾”簡單巢群的基因型頻率預期值有顯著差異，且每一位點的等位基因數都小于5時為“擴大巢群”，

③混合巢群的白蟻樣品在某些微衛星位點上有5個以上的等位基因時為“混合巢群”。

本發明利用微衛星DNA技術可以深入研究自然環境中白蟻巢群的生殖模式，從而了解相關的白蟻生殖生物學特征，不僅能有效地解決上述背景技術中所提到的問題，而且可以提高白蟻防治工作的針對性。

采用本發明對長沙10個黑胸散白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA鑒定表明：簡單巢群7個、擴大巢群2個和混合巢群1個。

具體實施方式

本發明由由樣品采集、基因組DNA提取、微衛星位點查找、引物設計及優化、基因型測定、卡方檢驗和生殖模式判定等7個關鍵步驟組成。

下面通過具體實施例詳述本發明。

樣品采集：在長沙采集10個黑胸散白蟻巢群的白蟻樣品，每個巢群采集工蟻25頭，兩個采樣點間的距離應在20m以上。采樣后，將工蟻放入樣品管中，用95％酒精浸泡，貼上標簽，在-20℃冰箱中保存備用。在采樣過程中，用手持GPS定位儀測定每個采樣點的經度、緯度和海拔高度。

基因組DNA提取：按照已有的動物組織基因組DNA提取試劑盒的方法提取所有樣品的基因組DNA。采用ND-2000微量紫外/可見分光光度計測定DNA濃度，并將提取的樣品DNA稀釋為10-20ng/μl待用。

微衛星位點查找：在已有的GenBank上查找與白蟻生殖模式相關的微衛星位點。