[發(fā)明專利]一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210006075.1 | 申請日： | 2012-01-06 |
| 公開（公告）號： | CN102559896A | 公開（公告）日： | 2012-07-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 黃求應(yīng);李剛?cè)A;雷朝亮 | 申請（專利權(quán)）人： | 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104 | 代理人： | 朱盛華 |
| 地址： | 430070 湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 鑒定 白蟻 群生 模式 衛(wèi)星 dna 方法 | ||
1.一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法，其特征在于具體步驟如下：
1)在野外采集同一巢群，20頭以上的白蟻樣品，將樣品放入裝有95％酒精的樣品管中，置于-20℃冰箱中備用，采樣過程中，測定每個采樣點的經(jīng)度、緯度和海拔高度；
2)提取白蟻樣品的基因組DNA，再用ND-2000微量紫外/可見分光光度計測定樣品DNA濃度，并統(tǒng)一稀釋成10-20ng/μl待用；
3)在GenBank上查找與白蟻生殖模式相關(guān)的微衛(wèi)星位點；
4)利用軟件Primer?Premier?5.0在微衛(wèi)星重復(fù)序列的側(cè)翼設(shè)計引物，選用微衛(wèi)星位點Rf24-2、Rf21-1、Rf6-1、Rs10和RS68的微衛(wèi)星引物對白蟻樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200PCR儀上進(jìn)行；用6.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，選用分子標(biāo)準(zhǔn)為50-350bp?IRDye800TM?standard，電泳在LI-COR4300DNA自動分析儀上進(jìn)行，再使用SAGAGT軟件測定電泳圖中每個條帶對應(yīng)樣品的基因型；
5)基于“孟德爾定律”對白蟻樣品的觀測基因型頻率與期望基因型頻率進(jìn)行卡方檢驗，再判定該白蟻巢群的生殖模式：
①簡單巢群的基因型頻率觀測值與“孟德爾”簡單巢群的基因型頻率預(yù)期值沒有顯著差異時為“簡單巢群”，
②擴(kuò)大巢群的觀測基因型種類數(shù)與“孟德爾”簡單巢群的預(yù)期基因型種類數(shù)不一致，或者經(jīng)X2檢驗后工蟻的基因型頻率觀測值與“孟德爾”簡單巢群的基因型頻率預(yù)期值有顯著差異，且每一位點的等位基因數(shù)都小于5時為“擴(kuò)大巢群”，
③混合巢群的白蟻樣品在某些微衛(wèi)星位點上有5個以上的等位基因時為“混合巢群”。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法，其特征在于設(shè)計引物的原則為：引物長度為19-25bp，GC含量40％-60％，退火溫度為45-65℃，預(yù)期PCR產(chǎn)物長度為100-300bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法，其特征在于根據(jù)不同引物的不同Tm值在PCR儀上進(jìn)行溫度梯度優(yōu)化，選擇20個樣品?等量混合，得到樣品DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法，其特征在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10μl，包括模板DNA(10ng/μl)2.0μl，ddH2O?4.8μl，1×Reaction?Buffer?1.0μl，MgCl2(2mmol/L)0.4μl，dNTPs(0.2mmol/L)0.8μl，5’端加有M13正向測序引物的正向引物(2pmol/μl)0.2μl，反向引物(2pmol/μl)0.2μl；帶有熒光標(biāo)記的M13引物(M13F-29/IRD?800)(0.32pmol/μl)0.32μl，Taq?polymerase(0.4U/μl)0.08μl；
PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30s；94℃變性30s，60℃退火30s，每循環(huán)一次降1℃，72℃延伸30s，6個循環(huán)；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；72℃延伸3min，4℃終止反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法，其特征在于基于“孟德爾定律”由工蟻基因型逆推出生殖蟻的預(yù)期基因型，再根據(jù)生殖蟻基因型推算出后代基因型的頻率預(yù)期值，再將工蟻基因型頻率觀測值與工蟻基因型頻率預(yù)期值進(jìn)行卡方檢驗。?
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