[發(fā)明專利]一種NOD/SCID小鼠異種移植物抗宿主病模型的建立方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210005931.1
• 申請(qǐng)日: 2012-01-10
• 公開（公告）號(hào): CN102550486A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃河;胡永仙;顧嫣珺;譚亞敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): A01K67/027
• 分類號(hào): A01K67/027;G01N21/84
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種NOD/SCID小鼠異種移植物抗宿主病模型的建立方法。建立具有模擬臨床異基因造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿主病特點(diǎn)的疾病模型，可為研究移植物抗宿主病的發(fā)生機(jī)制和診療方法提供研究平臺(tái)。

背景技術(shù)

移植物抗宿主病（GVHD）是異基因造血干細(xì)胞移植后的主要并發(fā)癥和死亡原因，成為阻礙移植成功的關(guān)鍵因素。降低或減輕GVHD的發(fā)生及程度相關(guān)的體外、動(dòng)物模型和臨床研究顯得尤為迫切。目前大部分GVHD動(dòng)物模型建立在不同H-2抗原不合的小鼠間移植，與人類造血干細(xì)胞移植后發(fā)生的GVHD存在一定的差異。近年來人源化免疫系統(tǒng)NOD/SCID小鼠的出現(xiàn)為在活體內(nèi)進(jìn)行人類免疫功能研究提供了可能。人源化免疫系統(tǒng)NOD/SCID小鼠是指在小鼠體內(nèi)建立人的免疫系統(tǒng)，該小鼠能夠提供研究人免疫系統(tǒng)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，對(duì)研究開發(fā)疫苗、藥物試驗(yàn)、腫瘤防治和移植排斥反應(yīng)等方面具有重要意義。人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型為GVHD研究提供了很好的疾病模型，經(jīng)典的該模型建立過程中首先需要對(duì)NOD/SCID小鼠進(jìn)行亞致死劑量輻照預(yù)處理，接著輸注一定數(shù)量的人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。亞致死劑量的輻照能夠抑制宿主的固有免疫，同時(shí)增加植入細(xì)胞所需要的龕位，所以亞致死劑量輻照是人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型成功建立的關(guān)鍵，但是國內(nèi)很多研究中心缺乏輻照相關(guān)的儀器設(shè)備從而限制了該模型的廣泛應(yīng)用。為此，本發(fā)明中我們應(yīng)用環(huán)磷酰胺藥物聯(lián)合抗小鼠CD122單克隆抗體預(yù)處理代替亞致死劑量輻照并回輸在體外預(yù)先用植物血凝素（PHA）活化的人PBMCs的方法建立了人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型，為國內(nèi)大多數(shù)研究中心能夠開展該模型相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種NOD/SCID小鼠異種移植物抗宿主病模型的建立方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：?

（1）活化的人PBMCs制備：取正常志愿者外周血標(biāo)本，肝素抗凝，應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液分離制備外周血單個(gè)核細(xì)胞，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640重懸細(xì)胞至細(xì)胞終密度為2×10⁶/ml，加入PHA和白介素-2（IL-2）共培養(yǎng)7天后準(zhǔn)備小鼠輸入用。

（2）NOD/SCID小鼠造模：實(shí)驗(yàn)前1周從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司購買6周齡無特定病原體（SPF）級(jí)NOD/SCID雄性小鼠，飼養(yǎng)于SPF級(jí)層流柜中，飼料及飲用水均經(jīng)無菌處理，并在飲用水中加入慶大霉素（32×10⁴U/L）和紅霉素（250mg/L）。小鼠輸入活化的人PBMCs當(dāng)天作為第0天，第0天前面的時(shí)間均以“-”表示。于-3至-1天進(jìn)行環(huán)磷酰胺聯(lián)合抗小鼠CD122單克隆抗體預(yù)處理，預(yù)處理后小鼠分為兩組，每組6只，一組為實(shí)驗(yàn)組，一組為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠中每只輸入制備好的活化人PBMCs，對(duì)照組小鼠輸入磷酸鹽緩沖液。之后每天定期觀察小鼠體重、腹瀉、皮膚GVHD表現(xiàn)（毛發(fā)脫落、紅斑等）、活動(dòng)情況等。

（3）小鼠人白細(xì)胞數(shù)量含量植入檢測：于第10天取小鼠血50μl，小鼠血進(jìn)行抗人CD45?FITC標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測人CD45陽性白細(xì)胞數(shù)量含量；取小鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液，進(jìn)行抗人CD45?FITC標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測人CD45陽性白細(xì)胞含量。

（4）小鼠GVHD靶器官的病理表現(xiàn)：待小鼠自然死亡后，取小鼠的肝臟、小腸和腎臟等各個(gè)器官進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色，查看各臟器中GVHD病理表現(xiàn)，并用抗人CD45單克隆抗體對(duì)各臟器進(jìn)行免疫組化檢測，查看人淋巴細(xì)胞在各臟器中的浸潤情況。

本發(fā)明通過應(yīng)用環(huán)磷酰胺藥物聯(lián)合抗小鼠CD122單克隆抗體預(yù)處理代替亞致死劑量輻照方法建立一種人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型。其具有如下特點(diǎn)：（1）該模型具有模擬臨床上化療預(yù)處理的異基因造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿主病的特點(diǎn)；（2）建模型效率高，重復(fù)性好；（3）造模過程簡單易行；（4）彌補(bǔ)了國內(nèi)很多研究中心缺乏輻照相關(guān)的儀器設(shè)備而不能進(jìn)行相關(guān)研究的缺陷，能為在活體動(dòng)物內(nèi)進(jìn)行人類免疫系統(tǒng)GVHD研究提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

附圖說明

圖1是對(duì)照組小鼠和實(shí)驗(yàn)組小鼠中分離的外周血細(xì)胞、脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的流式分析圖。

圖2是對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠處死后分離的肝臟、小腸和腎臟的病理活檢HE染色圖。

圖3是對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟、小腸和腎臟組織的抗人CD45單克隆抗體免疫組化圖。

具體實(shí)施方式