[發明專利]一種NOD/SCID小鼠異種移植物抗宿主病模型的建立方法

有效

• 申請號: 201210005931.1
• 申請日: 2012-01-10
• 公開（公告）號: CN102550486A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 黃河;胡永仙;顧嫣珺;譚亞敏
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;G01N21/84
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種NOD/SCID小鼠異種移植物抗宿主病模型的建立方法，通過以下步驟實現：?

（1）活化的人PBMCs制備：取正常志愿者外周血標本，肝素抗凝，應用人淋巴細胞分離液分離制備外周血單個核細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640重懸細胞至細胞終密度為2×10⁶/ml，加入PHA和白介素-2共培養7天；?

（2）NOD/SCID小鼠造模：實驗前1周取6周齡無特定病原體級NOD/SCID雄性小鼠，飼養于SPF級層流柜中，飼料及飲用水均經無菌處理，并在飲用水中加入慶大霉素32×10⁴U/L和紅霉素250mg/L，小鼠輸入活化的人PBMCs當天作為第0天，第0天前面的時間均以“-”表示，于-3至-1天進行環磷酰胺聯合抗小鼠CD122單克隆抗體預處理，預處理后小鼠分為兩組，每組6只，一組為實驗組，一組為對照組，實驗組小鼠中每只輸入制備好的活化人PBMCs，對照組小鼠輸入磷酸鹽緩沖液，之后每天定期觀察小鼠體重、腹瀉、皮膚GVHD表現、活動情況；

（3）小鼠人白細胞數量含量植入檢測：于第10天取小鼠血50μl，小鼠血進行抗人CD45?FITC標記，流式細胞術檢測人CD45陽性白細胞數量含量；取小鼠脾臟，制備單細胞懸液，進行抗人CD45?FITC標記，流式細胞術檢測人CD45陽性白細胞含量；

（4）小鼠GVHD靶器官的病理表現：待小鼠自然死亡后，取小鼠的肝臟、小腸和腎臟等各個器官進行常規石蠟包埋、切片，常規蘇木素-伊紅染色，查看各臟器中GVHD病理表現，并用抗人CD45單克隆抗體對各臟器進行免疫組化檢測，查看人淋巴細胞在各臟器中的浸潤情況。

2.根據權利要求1所述的一種NOD/SCID小鼠異種移植物抗宿主病模型的建立方法，其特征在于，步驟（2）皮膚GVHD表現是指毛發脫落、紅斑。