[發(fā)明專利]一種豬瘟疫苗及其制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210005619.2
• 申請(qǐng)日: 2012-01-10
• 公開（公告）號(hào): CN102559614A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張學(xué)賽;陳劍清;舒特俊;張耀洲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津耀宇生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/01
• 分類號(hào): C12N7/01;C12N15/62;C12N15/866;C07K19/00;A61K39/187;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京匯澤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 張艷贊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種豬瘟疫苗及其制備方法，尤其涉及豬瘟疫苗制備中重組質(zhì)粒和重組病毒的制備，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

豬瘟（hog?cholera,?HC)又稱古典豬瘟（classical?swine?fever,?CSF），是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性熱性傳染病，死亡率高達(dá)90%以上。1984年世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列入A類傳染病，也是世界糧農(nóng)組織和各國政府密切關(guān)注的主要傳染病之一。?

1908年匈牙利HutyraK-oves制成豬瘟高免血清后，人們一直用高免血清—血毒同時(shí)肌注來免疫豬群。但由于高免血清價(jià)格昂貴，獲取困難，加之血毒有散毒的危險(xiǎn)，因此各國學(xué)者在以后的60年間相繼研制出許多滅活疫苗，其中福爾馬林和結(jié)晶紫滅活疫苗曾被廣泛應(yīng)用。滅活疫苗雖然安全，但是保存期短。?

1955年，周泰沖等人將CSFV石門強(qiáng)毒株經(jīng)兔體214次傳代后成功制備出兔化弱毒株。繼續(xù)傳代480次，成為商品化的標(biāo)準(zhǔn)疫苗株。后來被命名為中國疫苗株（C-strain）或豬瘟兔化弱毒（HCLV）株，很多商品化的疫苗株都由其衍生而來。1957年以來廣泛用于世界許多國家，是目前世界上使用最廣泛的弱毒苗，對(duì)控制CSF流行起到了關(guān)鍵作用。相比其它商品化的疫苗，它的安全性更高，菌毒在豬體內(nèi)持續(xù)存在不超過3周，且不會(huì)引起仔豬和懷孕母豬發(fā)?。幻庖咝Ч?，免疫一次就能產(chǎn)生完全的保護(hù)，保護(hù)時(shí)間長達(dá)一年甚至終生。常規(guī)弱毒疫苗盡管安全有效，但存在免疫抗體與感染抗體不能區(qū)分的問題，不能通過血清學(xué)方法來檢測一個(gè)免疫豬群中的野毒感染，這對(duì)于豬瘟的防制與凈化非常不利，也正因?yàn)檫@個(gè)原因，采取豬瘟免疫政策國家的豬及其制品的出口受到嚴(yán)格限制，這就使得開發(fā)能用血清學(xué)方法區(qū)分免疫豬與感染豬的新型疫苗成為當(dāng)務(wù)之急。?

亞單位疫苗是一類能通過血清學(xué)方法方便的區(qū)分免疫動(dòng)物與感染動(dòng)物的疫苗。目前已有2種亞單位疫苗在歐盟獲得了注冊(cè)，這2種疫苗均是以桿狀病毒表達(dá)的CSFV?E2蛋白作為免疫原。但這種疫苗也存在一些缺陷，試驗(yàn)表明E2蛋白亞單位疫苗在免疫14d后才能產(chǎn)生對(duì)野毒感染的保護(hù)；同時(shí)，如果免疫時(shí)機(jī)體內(nèi)有低水平母源抗體存在，至少要免疫兩次才可誘導(dǎo)臨床保護(hù)，即使如此，大多數(shù)已經(jīng)產(chǎn)生臨床保護(hù)的豬在攻毒時(shí)仍會(huì)有發(fā)熱、白細(xì)胞減少和病毒血癥的情況出現(xiàn)。另外，E2蛋白亞單位疫苗能否預(yù)防水平傳播和垂直傳播也有待證實(shí)。?

重組活載體疫苗是最先開始研究的標(biāo)記疫苗，活載體疫苗能引起體液免疫和細(xì)胞免疫，且能在體內(nèi)復(fù)制，能誘導(dǎo)長期和高效的免疫保護(hù)。用于豬瘟標(biāo)記疫苗的病毒載體有痘病毒、偽狂犬病病毒（PRV）、豬腺病毒(PAV)等。但是它們都有明顯的缺陷：重組痘苗病毒可能對(duì)未接種過痘苗的人具有潛在的感染性；重組痘苗病毒傳播到環(huán)境中可能與野生型痘苗病毒發(fā)生重組，出現(xiàn)毒力返強(qiáng)現(xiàn)象；痘苗病毒對(duì)豬的感染性較低，必須注射高劑量的重組痘苗病毒才能誘導(dǎo)有效的保護(hù)；基于PRV載體疫苗不適用于偽狂犬病流行地區(qū)，因?yàn)镻RV抗體對(duì)于免疫及血清學(xué)檢測有一定影響；而?rPAV-E2和rPRV-E2雖然高效而且安全，但是沒有得到具體的疫苗試驗(yàn)或者田間實(shí)驗(yàn)證實(shí)。?

DNA疫苗具備很多優(yōu)勢，發(fā)展非常迅速，但也存在潛在的安全隱患，如質(zhì)粒DNA是否會(huì)整合到宿主基因組中、是否會(huì)引起免疫耐受等問題尚不清楚，且存在一定的安全隱患，此外DNA疫苗免疫效力尚有待進(jìn)一步提高。?

基于以上各種情況，研究新型、有效的豬瘟疫苗已為研究者的努力方向，而且E2、E0蛋白是豬瘟病毒的主要抗原位點(diǎn)，是豬瘟疫苗研制的主要靶點(diǎn)。?

桿狀病毒表面展示系統(tǒng)是近幾年發(fā)展起來的一種新的真核展示系統(tǒng)，可彌補(bǔ)原核展示系統(tǒng)的不足，并保持表面展示系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，通過篩選表達(dá)特異蛋白的重組桿狀病毒粒子即便于外源蛋白的純化，可用來展示需糖基化、二硫鍵異構(gòu)化等翻譯后修飾才表現(xiàn)功能活性的復(fù)雜真核蛋白，在高親和力抗體及多肽藥物的篩選、蛋白質(zhì)抗原表位分析等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。?

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種克服上述缺陷的豬瘟疫苗。本發(fā)明通過構(gòu)建一種重組家蠶桿狀病毒，并運(yùn)用桿狀病毒表面展示技術(shù)將豬瘟病毒的主要抗原基因E2、E0融合展示在家蠶桿狀病毒囊膜表面，以家蠶蛹作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組桿狀病毒，并以此重組桿狀病毒作為豬瘟疫苗原進(jìn)行生產(chǎn)，相比于傳統(tǒng)豬瘟疫苗生產(chǎn)具有安全性好、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高、易于操作、適用于大規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)。?

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：?