[發明專利]一種豬瘟疫苗及其制備方法

無效

• 申請號: 201210005619.2
• 申請日: 2012-01-10
• 公開（公告）號: CN102559614A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 張學賽;陳劍清;舒特俊;張耀洲
• 申請（專利權）人: 天津耀宇生物技術有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/62;C12N15/866;C07K19/00;A61K39/187;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張艷贊

1.一種家蠶重組桿狀病毒Bmgp64-E2-2A-E0,?該病毒保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.5604。

2.一種權利要求1所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64-E2-2A-E0的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(a)由PCR擴增的方法獲得桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列SP和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列TM，通過BamH?I/?EcoR?I和XhoI/Hind?III雙酶切插入pFastBacI載體多克隆位點上下游兩端，構建表面展示系統轉移載體pFastBacI-gp64；

(b)采用pvL1393-E2-2A-E0重組質粒為模板，以SEQ?ID:?NO.6和SEQ?ID:?NO.7為引物進行PCR擴增，構建融合基因E2-2A-E0；

(c)將步驟(b)所得的融合基因E2-2A-E0雙酶切產物克隆至步驟(a)所得表面展示系統轉移載體pFastBacI-gp64上，并篩選陽性克隆，獲得轉移重組質粒pFastBacI-gp64-E2-2A-E0；

(d)將步驟(c)所得轉移重組質粒pFastBacI-gp64-E2-2A-E0轉化大腸桿菌DH10Bac感受態細胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal和IPTG的LB培養板上進行藍白斑篩選，避光培養40-48h后挑取白斑，培養16-20h后菌液稀釋10⁶重新涂板做篩選，挑取白斑至LB培養基搖菌培養16-20h后，用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物做PCR鑒定；

(e)?取步驟(d)所鑒定成功的重組病毒基因組通過脂質體介導法轉染家蠶BmN細胞，發病后獲得零代病毒懸液0-4℃保存，提取病毒基因組用M13通用引物進行PCR鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64-E2-2A-E0。

3.一種權利要求1所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64-E2-2A-E0表達的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID:?NO.11所示。

4.一種權利要求3所述蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(a)將權利要求3所述的重組桿狀病毒Bmgp64-E2-2A-E0感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；

(b)以穿刺接種法接種家蠶五齡幼蟲、蛹；

(c)收集表達的權利3所述蛋白。

5.一種權利要求1所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64-E2-2A-E0在豬瘟疫苗制備中的應用。

6.一種權利要求3所述蛋白在豬瘟疫苗制備中的應用。