[發明專利]一種手足口病疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201210005587.6
• 申請日: 2012-01-10
• 公開（公告）號: CN102533860A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 于東寨;陳劍清;舒特俊;張耀洲
• 申請（專利權）人: 特菲（天津）生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66;C07K14/09;A61K48/00;A61K39/135;A61P31/14
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張艷贊

技術領域

本發明涉及一種手足口病疫苗及其制備方法，尤其涉及手足口病疫苗制備中的重組質粒和重組病毒的制備，屬于生物醫藥技術領域。?

背景技術

腸道病毒71型(enterovirus?71,?EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，其和柯薩奇病毒A16(CA16)是手足口病(HFMD)重癥病例的主要病原體，且能引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質炎樣的麻痹等多種與神經系統相關的疾病，致殘及病死率很高，備受人們關注。1974年Schmidt等人首次報道從美國加利福尼亞患者中分離到EV71，隨后世界上許多國家相繼報道了EV71在不同地區的流行情況。近年來，EV71感染引起的手足口病在亞太地區，尤其在我國北京、安徽、河南、山東等地較為嚴重。?

目前，EV71疫苗的研究已取得一定的進展，正在研發的疫苗包括滅活全病毒疫苗、減毒活疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、重組蛋白亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗和轉基因口服疫苗。雖然各種疫苗均具有一定的免疫原性和免疫效果，但最適疫苗的確認還需要對各種疫苗進行安全性和有效性的評價。Wu等比較了滅活病毒疫苗、VP1?DNA疫苗和重組VP1蛋白亞單位疫苗，雖然滅活病毒疫苗誘導的特異性免疫應答強度高于亞單位疫苗，但滅活疫苗存在安全性問題。因此，有人探究了安全性更高的病毒樣顆粒的免疫效果[Wu?CN,?Lin?YC,?Fann?C,?et?al.?Protection?against?lethal?enterovirus?71?infection?in?newborn?mice?by?passive?immunization?with?subunit?VP1?vaccines?and?inactivated?virus?[J].?Vaccine,?2001,?20(5-6):?895-904.]。Chung等研究表明，EV71病毒樣顆粒能引起較強的抗EV71免疫應答，有望成為一種新型EV71疫苗[Chung?YC,?Ho?MS,?WU?JC,?et?al.?Immunization?with?virus?like?particles?of?enterovirus71?elicit?potent?immune?responses?and?protects?mice?against?lethal?challenge?[J].?Vaccine,?2008,?26(15):?1855-1862.]。此外，國外有研究將VP1基因轉入西紅柿制備轉基因疫苗，也具有一定的保護效果。?

桿狀病毒表面展示系統是近幾年發展起來的一種新型的真核展示系統，通過在AcMNPV等Ⅰ型出芽病毒的糖蛋白gp64插入外源蛋白，二者融合表達或與特異性的錨定部位結合，幫助外源蛋白進行蛋白質翻譯后正確折疊和糖基化、磷酸化等加工修飾，尤其適合展示需在內質網等細胞內進行特異性翻譯后經加工修飾才具有生物活性的高等真核細胞分泌蛋白和表面蛋白。桿狀病毒表面展示技術已應用于新型疫苗的研制、基因轉導與基因治療、單克隆抗體的制備和抗原表位的分析等細胞、免疫與分子方面研究的各個領域，并已成為研究熱點。?

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供一種克服上述缺陷的手足口病疫苗。本發明通過構建一種重組家蠶桿狀病毒，并運用桿狀病毒表面展示技術將手足口病主要抗原蛋白(腸道病毒71型的主要抗原蛋白)基因EV71?VP1序列展示在家蠶桿狀病毒表面，以家蠶蛹作為生物反應器生產重組桿狀病毒，并以此重組桿狀病毒作為手足口病疫苗原進行生產，相比于傳統手足口病疫苗生產具有安全性好、生產成本低、產量高、易于操作、適用于大規模生產的特點。?

為達到上述目的，本發明的技術方案如下：?

一種家蠶重組桿狀病毒Bmgp64VP1，該病毒于2011年12月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心其簡稱為CGMCC(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為家蠶核型多角體病毒?(Bombyx?mori?nucleopolyhedrovirus），保藏編號為CGMCC?No.5603。

上述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64VP1的制備方法，包括以下步驟：?

(1)由PCR擴增的方法獲得桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，通過BamH?I/EcoR?I和Xho?I/HindⅢ雙酶切插入pFastBacI載體多克隆位點上下游兩端構建的表面展示載體pFastBacI-gp64；