[發(fā)明專利]一種手足口病疫苗及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210005587.6
• 申請(qǐng)日: 2012-01-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102533860A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于東寨;陳劍清;舒特俊;張耀洲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 特菲（天津）生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/866
• 分類號(hào): C12N15/866;C12N15/66;C07K14/09;A61K48/00;A61K39/135;A61P31/14
• 代理公司: 北京匯澤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 張艷贊

1.一種家蠶重組桿狀病毒Bmgp64VP1，該病毒保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.5603。

2.一種權(quán)利要求1所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64VP1的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)由PCR擴(kuò)增的方法獲得桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號(hào)肽基因序列和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，通過(guò)BamH?I?/EcoR?I和Xho?I?/HindⅢ雙酶切插入pFastBacI載體多克隆位點(diǎn)上下游兩端構(gòu)建的桿狀病毒表面展示載體pFastBacI-gp64；

(2)由PCR擴(kuò)增的方法獲得手足口病主要抗原蛋白基因EV71?VP1序列，其5’和3’端分別引入EcoR?I和Xba?I酶切位點(diǎn)后，連接到步驟(1)所得表面展示載體pFastBacI-gp64，構(gòu)建成重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBacI-gp64-VP1；

(3)取步驟(2)所得的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBacI-gp64-VP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素的LB培養(yǎng)板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，避光培養(yǎng)40~48h后挑取白斑，培養(yǎng)20~24h后用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物做PCR鑒定；

(4)取步驟(3)所鑒定成功的重組桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，發(fā)病后收集1.5~2ml細(xì)胞液，4℃，5000rpm離心10~15min，獲得含重組病毒的沉淀，提取病毒基因組用M13引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64VP1。

3.一種權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒Bmgp64VP1表達(dá)的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：10所示。

4.一種權(quán)利要求3所述抗原蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)將權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒Bmgp64VP1感染家蠶BmN細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增；

(2)針刺接種法接入家蠶五齡幼蟲(chóng)、蛹；

(3)收集表達(dá)的權(quán)利3所述抗原蛋白。

5.一種權(quán)利要求1所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64VP1在手足口病疫苗制備中的應(yīng)用。

6.一種權(quán)利要求3所述的蛋白在手足口病疫苗制備中的應(yīng)用。