[發明專利]產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和增殖的培養方法

有效

• 申請號: 201210005499.6
• 申請日: 2012-01-10
• 公開（公告）號: CN102550416A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 涂藝聲;丁明華
• 申請（專利權）人: 江西師范大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種植物生物技術，即離體誘導和增殖的培養方法，尤其涉及一種產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和增殖的培養方法。

背景技術

蛇足石杉Huperzia?serrata(Thunb.ex?Murray)Trev.，又名千層塔、蛇足石松、蛇足草等，為石杉科石杉屬蕨類植物，全草入藥。自1972年國內首次報道該植物中的生物堿-石杉堿甲(hupenine?A，Hup-A)具有橫紋肌松馳作用，以后深入研究發現該生物堿是一種強效、可逆和高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑。在低劑量Hup-A下對乙酰膽堿酯酶(Ach?E)有強大的抑制作用，使分布區內神經突觸間隙的乙酰膽堿(Ach)含量明顯升高，從而增強神經元興奮傳導，強化學習與記憶腦區的興奮作用，起到提高認知功能、增強記憶保持和促進記憶再現的作用。是目前國內最為成功的治療阿爾茨海默病(老年性癡呆癥)的藥物。石杉堿甲Hup-A藥物主要來源于天然蛇足石杉全草，由于石杉堿甲的特殊療效，國內外學者對它的全合成、衍生物及類似物的合成作了大量的工作，亦因Hup-A特殊的分子結構，人工合成費時費力，代價高，至今幾乎沒有得到活性比天然Hup-A更好的衍生物和類似物，因此人工合成的Hup-A及其類似物離商品化生產還有較長距離，隨著老年化社會到來，阿爾茨海默病(老年性癡呆癥)已成為人類的第四大病魔，直接導致國際市場上Hup-A的供應缺口越來越大，自然千層塔資源匱乏凸顯。

由于蛇足石杉等石杉科植物生長于深山密林，生境條件特殊，很難解決石杉科植物大面積的人工栽培。采取石杉科植物離體組織培養能開發石杉屬植物中Hup-A資源，但因外植體消毒及其生長分化困難，目前國內外尚未突破其有效的技術。而蛇足石杉離體培養是開發其原植物快繁或生物技術生產天然石杉堿甲(Hup-A)資源的重要技術平臺，必須首先建立有效的離體培養無性增殖體系。

發明內容

本發明的目的在于提供一種產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和增殖的培養方法，該方法簡單，便于大規模生產使用。

本發明是這樣實現的，方法步驟為：

(1.1)材料：蛇足石杉(Huperzia?serrata(Thunb.ex?Murray)Trev.，選擇健壯無病蟲害的廬山野生蛇足石杉植株，取當年抽生約3cm長的新枝；

(1.2)對外植體清洗消毒；

(1.3)外植體接種在葉狀體分化啟動培養基上培養至切口處出現綠色小凸點，繼續在葉狀體分化啟動培養基上培養10～15天，綠色小凸點發育成可辨的葉狀體組織，此時的葉狀體組織迅速增殖；葉狀體分化啟動培養基：1/2(6，7-V)+NAA0.1～1.0mg/L，蔗糖用量20～30g/L；

(1.4)將誘導增殖的葉狀體組織分割成小塊，每瓶45ml左右培養基接種1.0g至1.5g，轉接到葉狀體繼代增殖培養基上培養，葉狀體繼代增殖培養基：6，7-V+NAA0.1～1.5mg/L或IAA0.1～1.0mg/L，蔗糖用量20～30g/L；

(1.5)葉狀體分割繼代；一小部分葉狀體切割作繼代小塊，接種到繼代增殖培養基上繼代培養，以后每40～50天轉代一次，每世代葉狀體生物量鮮重比接種量增加8～13倍，建成葉狀體無性繁殖系；另一大部分葉狀體收獲可提取石杉堿甲。

本發明方法所用的培養基如下：

(1)適用的基本培養基：6，7-V，并蔗糖用量范圍20～30g/L，

(2)葉狀體分化啟動培養基：1/2(6，7-V)+NAA0.1～1.0mg/L；

(3)葉狀體繼代增殖培養基：6，7-V+NAA0.1～1.5mg/L或IAA0.1～1.0mg/L；以上培養基的pH值5.8～6.0、瓊脂粉質量分數0.6％，并在溫度118～120℃暨壓力0.8～1.0公斤/平方厘米的高溫高壓下滅菌25min。

本發明的培養條件如下：

(1)培養參數：恒溫24±2℃，相對濕度60％～70％，光照強度為1000～1500lx，日照時長11～14h/d；

(2)技術參數：外植體污染率低于10％～20％；葉狀體誘導率50％～80％；每世代葉狀體生物量鮮重比接種量增加8～13倍；繼代周期40～50d；本發明建立了生產石杉堿甲的蛇足石杉原植物再生葉狀體組織的離體無性增殖系，該葉狀體能生產積累石杉堿甲。