[發(fā)明專利]一種檢測(cè)利瑪原甲藻的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210005132.4
• 申請(qǐng)日: 2012-01-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102433390A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐晨;董麗;何培民;饒濤;賈睿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/06;G01N21/64
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體為檢測(cè)利瑪原甲藻的方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)階段，我國(guó)對(duì)有害藻類的認(rèn)識(shí)多側(cè)重在浮游藻類，而對(duì)底棲藻類的研究工作還處于起始階段，這就使得在過(guò)去的近岸海域生態(tài)調(diào)查時(shí)對(duì)底棲藻類鮮有記錄。但是，隨著我國(guó)有毒有害赤潮頻發(fā)，使得水產(chǎn)品品質(zhì)受到損害，食品安全問(wèn)題成為人們首要關(guān)心的問(wèn)題。由于便于培養(yǎng)及所分泌的毒素易制作成標(biāo)準(zhǔn)品，產(chǎn)毒底棲甲藻利瑪原甲藻成為研究人員研究產(chǎn)毒藻類的重點(diǎn)內(nèi)容。

利瑪原甲藻常附生于大型海藻、海草、底層沉積物表面，以及珊瑚礁或紅樹(shù)林區(qū)域的浮砂碎石上，有著不同于浮游藻類的生態(tài)習(xí)性。它呈世界性分布，在我國(guó)南海海域也有報(bào)道。王朝暉等曾于1997年秋至1998年春對(duì)廣東沿海多次赤潮進(jìn)行研究時(shí)，在珠海附近的米氏裸甲藻(Gymnodinium?mikimotoi)赤潮發(fā)生區(qū)域的底層水樣中檢測(cè)出大量利瑪原甲藻，濃度約為800Cells/L。利瑪原甲藻能夠產(chǎn)生包括OA(Okadaic?Acid)和DTX-1(Dinophysistoxin-1)等在內(nèi)的多種腹瀉性貝類毒素(Diarrhetic?Shellfish?Poisoning，DSP)。腹瀉性貝類毒素一般以貝類作為載體，被濾食后在貝類體內(nèi)富集，再通過(guò)食物鏈傳遞被人類或動(dòng)物吸收，直接威脅到人類及動(dòng)物的健康，甚至生命。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，它能致使腸黏膜損傷，在一定程度上促進(jìn)腫瘤并發(fā)。腹瀉性貝類毒素同西加魚(yú)毒(Ciguatera?Fish?Poisoning，CFP)、神經(jīng)毒性貝類毒素(Neurotoxic?Shellfish?Poisoning，NSP)等一樣，屬于聚酮類化合物。這類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，構(gòu)型變化較多，主要由聚酮合酶(Polyketide?Synthetase，PKS)催化形成。研究發(fā)現(xiàn)聚酮合酶以三種基本類型出現(xiàn)，而第一類型(Type?Ⅰ)為多功能酶，由單一蛋白基團(tuán)及其周圍功能區(qū)域構(gòu)成，是目前研究最為深入的類型。但它是否存在于甲藻中還有爭(zhēng)議，但依據(jù)對(duì)聚酮合酶基因的研究來(lái)看，其在一些產(chǎn)DSP毒素的甲藻中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，并證實(shí)在甲藻體外共生菌體內(nèi)不存在。本發(fā)明是在此基礎(chǔ)上，篩選利瑪原甲藻中存在的聚酮合酶基因，克隆及測(cè)序后，設(shè)計(jì)特異引物及探針，并連同針對(duì)其rDNA?ITS(ITS1-5.8S?rRNA-ITS2)序列設(shè)計(jì)的特異引物和探針，初步建立雙TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)方法檢測(cè)利瑪原甲藻。TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與常規(guī)PCR技術(shù)相比存在許多優(yōu)勢(shì)，它無(wú)需借助凝膠電泳或銀染獲取檢測(cè)結(jié)果，可直接通過(guò)光電傳導(dǎo)系統(tǒng)探測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)的變化得以知曉檢測(cè)結(jié)果；而且，它較雙鏈DNA內(nèi)嵌染料(如SYBR?green)定量PCR技術(shù)無(wú)法區(qū)分特異性和非特異性產(chǎn)物而言，TaqMan探針具有很高的特異性、信噪比，且可以進(jìn)行多重檢測(cè)。正是因?yàn)橐陨咸攸c(diǎn)，它已被研究人員用于部分有害藻類的檢測(cè)中。本發(fā)明也是借助該技術(shù)，期望以此可以提高對(duì)產(chǎn)毒底棲甲藻的實(shí)際檢測(cè)效率和精度，有助于進(jìn)一步實(shí)施在海洋環(huán)境中的檢測(cè)，也為建立早期赤潮預(yù)警機(jī)制提供必要支持。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種檢測(cè)利瑪原甲藻的方法，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。

技術(shù)方案為：針對(duì)利瑪原甲藻的聚酮合酶基因PKS及rDNA?ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，利用實(shí)時(shí)(real-time)PCR方法熒光定量檢測(cè)。

一種檢測(cè)利瑪原甲藻的方法，步驟包括：

(1)用CTAB改良法提取待測(cè)水樣中的利瑪原甲藻的基因組DNA；

(2)用特異性引物和特異性探針，擴(kuò)增利瑪原甲藻的ITS和PKS序列中的至少一種，采用熒光定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測(cè)水樣中瑪原甲藻含量；

rDNA?ITS基因序列的特異性引物為：上游cttggaatggcgcaacaagc，下游aaaccacaagacacgatgaaacg；即SEQ?ID?No.1和No.2；

PKS基因序列的特異性引物為：上游atccccagcaacgattattaatgg，下游tgcgtgaaagcgaagagtcc；即SEQ?ID?No.3和No.4；

rDNA?ITS基因序列的TaqMan探針包括以下核苷酸序列：

ccaaacctgccaccgttcctcgct；即SEQ?ID?No.5；

PKS基因序列的TaqMan探針包括以下核苷酸序列：

cggctcgctccaacgcttcccaac；即SEQ?ID?No.6。